عنوان

بررسي تنوع بيماريزايي جدايه‌هاي قارچ Fusarium verticillioides بر روي ذرت و واكنش تعدادي از ژنوتيپ‌هاي ذرت نسبت به پوسيدگي فوزاريومي بلال

استاد راهنما:

دكتر وحيد رهجو

استادان مشاور:

دكتر مهدي پيرنيا

مهندس مجيد زماني

تكه هايي از متن به عنوان نمونه :
فهرست مطالب
چكيده ۱
فصل اول: مقدمه و كليات
۱-۱- مقدمه و كليات ۳
فصل دوم: پيشينه تحقيق
۲-۲- گياه ذرت. ۶
۲-۱-۱ تاريخچه و اهميت ذرت ۶
۲-۱-۲- گياهشناسي ذرت ۷
۲-۲- بيماري پوسيدگي فوزاريومي بلال ۸
۲-۲-۱- تاريخچه، پراكنش و اهميت بيماري ۸
۱-۲-۲- قارچ عامل پوسيدگي فوزاريومي بلال. ۹
۲-۲-۳- روش هاي شناسايي عوامل بيماري. ۱۱
الف) شناسايي بر اساس ويژگيهاي مورفولوژيكي ۱۱
ب) شناسايي بر اساس ويژگيهاي بيولوژيكي. ۱۲
ج) شناسايي بر اساس ويژگيهاي مولكولي. ۱۲
۲-۲-۴-علائم بيماري. ۱۲
۲-۲-۵-زيست‌شناسي عامل بيماري. ۱۳
الف) چرخه بيماري ۱۳
ب) اپيدميولوژي ۱۴
راه هاي انتشار. ۱۵
عوامل موثر در خسارت. ۱۵
ج- متابوليت‌هاي ثانويه. ۱۶
د) هتروتاليسم ۲۰
۲-۳- كنترل بيماري ۲۱
۲-۴- مكانيسمهاي مقاومت به بيماري ۲۳
۱) مصونيت Immunity 23
2) فرار (Eascape) 23
3) تحمل (Tolerance) 23
2-5- غربالگري براي ارقام مقاوم به بيماري. ۲۴
۲-۶- ارتباط بين مقاومت ارقام و ميزان فومونسين ۳۰
فصل سوم: مواد و روشها
۳- مواد و روش‌ها ۳۲
۳-۱- نمونه‌برداري۳۲
۳-۲- جداسازي، خالص‌سازي و نگهداري جدايه‌ها ۳۲
۳-۳- محيط كشت‌ها. ۳۳
۳-۳-۱- محيط كشت سيب‌زميني- دكتروز- آگار (P.D.A). 33
3-3-2- محيط كشت آب-آگار (W.A) Water Agar 33
3-3-3- محيط كشت برگ ميخك- آگار (CL.A). 33
3-3-4- محيط كشت كلرورپتاسيم (KCl) 34
3-3-5- محيط كشت Special Nutrient Agar (S.N.A). 34
3-4- شناسايي گونه‌هاي فوزاريوم ۳۴
۳-۵- آزمون بيماريزايي. ۳۵
۳-۵-۱- آزمون بيماريزايي در گلخانه. ۳۵
الف- انتخاب جدايه‌ها و كشت بذرهاي ذرت در گلخانه. ۳۵
ب) آماده‌سازي مايه تلقيح و مايه زني ساقه‌هاي ذرت. ۳۵
ج) ارزيابي شدت بيماري (DS) 37
3-5-2- آزمون بيماريزائي جدايه‌هاي F. verticillioides بر روي ساقه در مزرعه. ۳۷
الف) انتخاب جدايه ها ۳۷
ب) تهيه مايه آلوده‌كننده و مايه‌زني ساقه‌هاي ذرت. ۳۷
ج) ارزيابي ۳۸
۳-۵-۳- آزمون بيماريزايي جدايه‌هاي F. verticillioides بر روي خوشه در مزرعه. ۳۹
الف: انتخاب جدايه ها. ۳۹
ب: تهيه مايه آلوده‌كننده و مايه‌زني ساقه‌هاي ذرت. ۳۹
ج: ارزيابي شدت بيماري و درصد آلودگي ۴۰
۳-۶- ارزيابي واكنش مقاومت ژنوتيپ‌هاي مختلف ذرت نسبت به عامل بيماري در مزرعه. ۴۰
الف) انتخاب جدايه‌ها و ژنوتيپ‌هاي ذرت ۴۱
ب) تهيه مايه آلوده‌كننده و مايه‌زني بلالهاي ذرت ۴۲
ج) ارزيابي شدت بيماري. ۴۳
۳-۷- بررسي ميزان فومونيسين در ژنوتيپ‌هاي مختلف ذرت ۴۴
الف) نمونه‌برداري و آماده‌سازي نمونه‌ها براي آزمون ELISA 45
ب) مراحل استخراج فومونيسين كل. ۴۶
ج) انجام آزمون الايزا. ۴۶
د) ارزيابي الايزا. ۴۷
فصل چهارم: نتايج و بحث
۴- نتايج. ۵۰
۴-۱- جداسازي و شناسايي گونه‌هاي فوزاريوم. ۵۰
الف) ويژگي‌هاي جدايه‌هاي قارچ F. verticillioides (Sacc.) Nirenberg. 50
ب) ويژگي‌هاي جدايه‌هاي قارچ F. proliferatum (Matsushima) Nirenberg 53
4-2- بررسي بيماريزايي جدايه هاي قارچ F. verticillioides با روش مايه زني ساقه در رقم حساس ذرت در گلخانه       55
4-3- بررسي بيماريزايي جدايه هاي قارچ F. verticillioides با روش مايه زني ساقه در مزرعه در روي لاين حساس MO17       57
4-4- بررسي تنوع بيماريزايي جدايه هاي قارچ F. verticillioides با روش مايه زني خوشه لاين حساس MO17 در مزرعه       60
4-5- ارزيابي واكنش مقاومت ژنوتيپ هاي مختلف ذرت نسبت به جدايه هاي مهاجم قارچ
F. verticillioides در مزرعه در منطقه ساري . ۶۲
۴-۶- ارزيابي واكنش مقاومت ژنوتيپ هاي مختلف ذرت نسبت به مخلوط جدايه هاي مهاجم قارچ
F. verticillioides با دو روش مايه زني ، تزريق با سرنگ و ايجاد زخم در بلال در مزرعه در منطقه كرج         66
4-7- ارزيابي واكنش مقاومت ژنوتيپ هاي مختلف ذرت نسبت به جدايه هاي مهاجم قارچ
F. verticillioides با روش مايه زني ايجاد زخم در بلال در مزرعه در مناطق كرج و ساري . ۷۲
۴-۸- بررسي ميزان توليد فومونيسين كل در ژنوتيپ هاي مختلف ذرت ۷۵
فصل پنجم : بحث و نتيجه گيري
۵ – بحث ۸۳
۵-۱- شناسايي گونه غالب عامل پوسيدگي خوشه ذرت . ۸۳
۵-۲- آزمون هاي بيماريزايي ۸۴
۵-۳- آزمون ارزيابي واكنش ژنوتيپ هاي ذرت به عامل پوسيدگي فوزاريومي بلال . ۸۵
۵-۴- آزمون بررسي توليد ميزان فومونيسين كل ۹۰
۵-۵- نتيجه گيري و پيشنهادات . ۹۳
منابع و مآخذ ۹۵
چكيده
يكي از مهم‌ترين بيماريهاي ذرت، بيماري پوسيدگي فوزاريومي بلال (Fusarium ear rot) مي‌باشد كه داراي پراكنش جهاني است. قارچ عامل بيماري عمدتاً گونه Fusarium verticillioides مي‌باشد، كه باعث كاهش كمي و كيفي در عملكرد ذرت مي‌شود. اين بيماري در ايران در مناطق شمالي و ذرت خيز از بيماريهاي مهم ذرت به شمار مي‌رود.
در سال ۱۳۸۸، به منظور شناسايي عوامل بيماري و تعيين گونه غالب آن، از مزارع مختلف مناطق اصفهان، ساري، كرمانشاه و كرج از بلالهاي آلوده نمونه‌برداري صورت گرفت.
پس از جداسازي و خالص‌سازي تعداد ۴۰ جدايه فوزاريوم (۳۲ جدايه F. verticillioides و ۸ جدايه
F. proliferatum ( بر اساس خصوصيات مورفولوژيكي و با استناد به كليدهاي معتبر قارچ‌شناسي مورد شناسايي قرار گرفت. بدين ترتيب قارچ F. verticillioides با فراواني %۸۰ به عنوان گونه غالب عامل بيماري فوق و قارچ F. proliferatume با فراواني %۲۰ به عنوان گونه دوم عامل بيماري معرفي شدند. بيماريزايي گونه هاي شناسايي شده طي آزمونهاي گلخانه‌اي و مزرعه‌اي به اثبات رسيد. نتايج حاصل از آزمايشات بيماريزايي جدايه‌ها نشان داد كه جدايه‌هاي F. verticillioides داراي قدرت بيماريزايي متفاوتي مي‌باشند، و در گروه هاي مختلف قرار گرفتند. نتايج حاصل از اين بررسي‌ها نشان داد كه بين دو آزمايش گلخانه و مزرعه همبستگي نسبتاً پائيني r=0.45) ( وجود دارد . در اين بررسي مقاومت ۱۰ ژنوتيپ مختلف ذرت با دو روش مايه‌زني، ايجاد زخم در بلال (Nail Punch) و تزريق در نوك بلال (Tip injection) در دو منطقه ساري و كرج مورد ارزيابي قرار گرفت. به منظور اين بررسي از مخلوط هشت جدايه برتر
F. verticillioides كه در آزمون گلخانه اي بيماريزايي بيشتري داشتند به عنوان مايه تلقيح با غلظت ۱۰^۶ اسپور در هر ميلي‌ليتر استفاده شد. نتايج حاصل از اين بررسي نشان داد كه ژنوتيپ‌ها از نظر حساسيت به بيماري پوسيدگي فوزاريومي بلال با همديگر متفاوت بوده و لاين K18 در هر دو منطقه در مقايسه با لاين‌ها از مقاومت بهتري برخوردار بوده است. نتايج بررسي توليد مايكوتوكسين فومونيسين كل در ژنوتيپ‌ها ي مختلف ذرت كه توسط ELISA در دو منطقه ساري و كرج صورت گرفت، سطوح مختلفي از فومونيسين كل را در بين ژنوتيپ‌هاي مختلف ذرت نشان داد. نتايج حاصل از بررسي ميزان حساسيت به بيماري و ميزان تجمع فومونسين حاكي از آن است كه مابين مقاومت ژنوتيپ‌ها و ميزان تجمع فومونسين رابطه‌اي مستقيم وجود دارد بطوريكه لاين K18 به عنوان ژنوتيپ مقاوم با كمترين ميزان فومونيسين   در هر دو منطقه مشاهده گرديد .، و لاين K19 به عنوان حساس ترين ژنوتيپ با بيشترين ميزان فومونيسين شناخته شد.
كلمات كليدي: ذرت، شناسايي، فوزاريوم، مقاومت، فومونيسين.
مقدمه و كليات
ذرت يكي از مهمترين گياهان زراعي است كه در اكثر كشورهاي جهان كشت مي‌شود. اين گياه به عنوان سلطان غلات معروف است، زيرا ارزش آن در جهان از گندم، جو، يولاف و برنج بيشتر است. ذرت به دليل داشتن تنوع و كيفيت و عادات رشد مختلف به عنوان يكي از بهترين گياهان زراعي مورد استفاده قرار مي گيرد. ذرت يكي از پرمحصول‌ترين غلات بشمار مي‌رود و از لحاظ مقدار كل توليد بعد از گندم و برنج سومين محصول غله‌اي جهان است. توليد غذا براي جمعيت روز افزون جهان مهمترين مشكل جوامع بشري است. غذاي اصلي انسان اغلب از فرآورده‌هاي گيا هان تيره غلات به ويژه گندم ،برنج و ذرت تامين مي‌گردد.
طبق آمار سازمان خواربار جهاني (FAO) در كشورهاي توسعه يافته ۷۸% ازذرت توليدي براي تغذيه دام وفقط ۶% به عنوان غذاي انسان استفاده مي‌شود و مابقي مصرف صنعتي دارد. در حاليكه در كشورهاي درحال توسعه ۵۰% به عنوان علوفه و۴۰% به طور مستقيم صرف تغذيه انسان و باقيمانده آن براي مصارف صنعتي يا جهت بذر به صورت واريته‌هاي آزاد گرده‌افشان بكار مي‌رود (Anonymous, 2006). با توجه به اهميت ذرت در تغذيه دام و طيور و همچنين قدرت تطابق و سازگاري اين گياه با شرايط اقليمي متفاوت و استفاده از بذر هيبريد و مكانيزه شدن كشت ذرت طي سالهاي اخير، سطح زير كشت و متوسط عملكرد آن در واحد سطح در كشور افزايش قابل توجهي پيدا نموده است .اصلاح ذرت در جهت افزايش عملكرد دانه، علوفه سيلويي و مقاومت در برابر آفات و بيماريهاي گياهي بر پايه اصلاح جمعيت‌ها و توليد واريته‌هاي هيبريد مي باشد. در اين راستا لازم است صفاتي كه به طور مستقيم و يا غير مستقيم روي عملكرد موثر هستند شناسايي گردد و نقش هر يك از اين صفات در عملكرد مشخص گردد. عوامل متعددي مانند آفات و بيماريها باعث كاهش عملكرد مي شوند. پوسيدگي بلال ذرت يكي از مهم‌ترين بيماريهاي ذرت در سراسر دنيا بخصوص در مناطق گرمسيري و نيمه‌گرمسيري مي باشد. اين بيماري هر ساله علاوه بر خسارات كمي خسارات كيفي نيز به بار مي‌آورد. بيماري در مزرعه قادر است تا۹۵% محصول را خسارت بزند
(Jeffere et al., 1994).
بروز اين بيماري در قاره‌هاي امريكا، اروپا، اسيا، افريقا گزارش شده است (MCGee, 1988). در ايران اين بيماري در مناطق شمالي كشور مانند گرگان، ساري و بندرانزلي گزارش شده است (مهريان وبامداديان، ۱۳۶۹). پوسيدگي بلال عمدتاً با دانه‌هاي آلوده و پراكنده‌اي كه با ميسليوم سفيد مايل به صورتي پوشيده است مشخص مي‌گردد (Farrar & Davis, 1991). در سالهاي اخير نقش اين بيماري با توجه به توكسين‌هايي كه توسط گونه‌هاي مختلف F. verticillioides، F. proliferatim،
F. moniliforme و Fusarium nyganai توليد مي‌شوند در كاهش كيفيت ذرت و ايجاد مسموميت در انسان و دام نقش ويژه‌اي دارد (Leslie & Summerell, 2006). فومونيسين‌ها گروه خاصي ازمايكوتوكسين‌ها هستند كه عمدتاً در ذرت و فراوردهاي آن ايجاد مي‌شوند. با توجه به اينكه براي مبارزه با هر بيماري شناخت بيمارگر ضروريست و عدم توفيق در كنترل بيماري نتيجه عدم درك و شناخت پاتوژن مي‌باشد، بنابراين شناسايي گونه‌هاي مختلف عامل بيماري و بررسي ميزان فومونيسين مترشحه آنها در مديريت بيماري و تضمين سلامت غذايي مصرف كنندگان بسيار مهم مي‌باشد. لذا بررسي دقيق و انجام تحقيق در ارتباط با ميزان توكسين قارچ و احتمال كاهش آن با بهره‌گيري از ژنوتيپ‌هاي مقاوم در مناطق شيوع بيماري ضروري بنظر مي‌رسد. يكي از مهمترين راه هاي كنترل اين بيماري و كاهش ميزان مايكوتوكسين‌هاي مضر مترشحه قارچ عامل بيماري، شناسايي و دستيابي به ارقام مقاوم مي‌باشد كه تنها از طريق آلوده‌سازي به طور مصنوعي در مزارع و طي چند سال بدست مي‌آيد. در اين تحقيق پس از تعيين تنوع بيماريزايي جدايه‌هاي قارچ عامل بيماري، ژنوتيپ‌هاي مختلف ذرت از نظر ميزان مقاومت به بيماري سنجيده شده و اينكه آيا ارتباطي بين مقاومت به قارچ عامل بيماري و ميزان فومونيسين كل توليد شده وجود دارد يا خير مورد بررسي قرار مي گيرد. كاربرد نتايج اين تحقيق در برنامه‌هاي اصلاحي جهت توليد ارقام مقاوم ذرت با ميزان فومونيسين پايين و هيبريدهاي متحمل به بيماري پوسيدگي فوزاريومي خوشه يا بلال باعث افزايش كمي و كيفي محصول در مزارع زير كشت خواهد شد و از نظر ارتقاي سلامت غذايي در مصرف كنندگان مي‌تواند بسيار با اهميت و ارزشمند باشد. اين تحقيق جهت نيل به اهداف عمده زير طرح‌ريزي و انجام گرديد.
۱ – شناسايي قارچ عامل پوسيدگي فوزاريومي خوشه ذرت و تعيين گونه غالب عامل بيماري
۲- بررسي تنوع بيماريزايي جدايه‌هاي قارچ عامل بيماري
۳- ارزيابي ژنوتيپ‌هاي ذرت از نظر ميزان مقاومت به بيماري
۴- رديابي و تعيين ميزان توليد فومونيسين كل در ژنوتيپ‌هاي مختلف ذرت
۵- ارتباط بين ميزان توليد فومونيسين كل و ميزان مقاومت به بيماري پوسيدگي فوزاريومي ذرت در ژنوتيپ‌هاي تحت بررسي.
۲- مروري بر مطالعات انجام شده
۲-۱- گياه ذرت
۲-۱-۱ تاريخچه و اهميت ذرت
ذرت Corn) Maize= ) يكي از كهن‌ترين گياهان روي زمين مي‌باشد. منشاء اوليه ذرت آمريكاي مركزي است (نصيري، ۱۳۸۵). ذرت اصلي‌ترين زراعت جهت تامين مواد غذايي در آمريكاي شمالي، مركزي و جنوبي قبل از كشف قاره جديد بوده است. پژوهشهاي باستان‌شناسي در كشور مكزيك مشخص نموده است كه ذرت قريب به ۴۵۰ سال قبل از ميلاد در آنجا كشت گرديده است . وجود بوته ذرت در دست
Taloc Aztec خداي باران متعلق به تمدنهاي قديمي مكزيك دليل كشت آن در زمانهاي دور است (نورمحمدي، ۱۳۷۶). ذرت نه تنها به عنوان غذاي اصلي مردم محسوب مي‌گرديده، بلكه نقش و اهميت بسيار مهمي در زندگي مردم، آداب و مراسم مذهبي و تاريخ مردم در آمريكاي جنوبي، مركزي و شمالي داشته است (نصيري، ۱۳۸۵). وايلوف مبدأ اوليه ذرت را در جنوب مكزيك، آمريكاي مركزي، آمريكاي جنوبي، مركز آمريكاي جنوبي (پرو، اكوادور، بوليوي) ذكر مي‌كند. در سال ۱۴۹۳ ميلادي ذرت از قاره آمريكا توسط كريستف كلمب وارد قاره اروپا گرديد و اروپائيان اين گياه را به نام Marisi يا Mahiz كه يك نام بومي در سرزمين سرخ‌پوستان بود، ناميدند. اوايل قرن شانزدهم ميلادي پرتقاليها ذرت را وارد اندونزي، آفريقا، هندوستان و چين نمودند (نورمحمدي، ۱۳۷۶). كشت آن در قرن هفدهم ميلادي رونق گرفت و لينه (Linne )در سال ۱۷۳۷ ميلادي نام علمي Zea mays L. را براي آن برگزيد (پورصالح، ۱۳۷۳).
كلمه Zea لغتي يوناني است كه ريشه آن Zoein به معني زندگي است Zea (Zeia) به دانه‌هاي پوشيده به ويژه Triticum spelta (گياه ضروري براي زندگي انسان) لحاظ مي‌گرديده است (نورمحمدي، ۱۳۷۶). ذرت حاوي ويتامين A و B1 (تيامين) و ويتامين B6 (ريبوفلاوين) مي‌باشد. ريبوفلاوين آن بيشتر از گندم و جود بوده و حدود ppm 02/1 است. همچنين از ذرت در تهيه گلوتن خوراكي- صنايع