دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشكده‌كشاورزي
پايان نامه براي دريافت درجه كارشناسي ارشد
رشته مهندسي كشاورزي بيوتكنولوژي كشاورزي
گرايش كشاورزي
عنوان
القاء موتاسيون نقطه‌اي با بهره گرفتن از EMS در گياه بادرنجبويه Melissa officinalis
استاد راهنما
دكترسيدكمال كاظمي‌تبار
استاد مشاور
دكترجعفرمسعودسينكي
تكه هايي از متن به عنوان نمونه :
| فهرست مطالب | |
| صفحه | عنوان |
| ۱ | چكيده. |
| فصل اول: مقدمه و كليات | |
| ۲ | ۱-۱ مقدمه |
| ۴ | ۱-۱-۱ اهميت موضوع. |
| ۴ | ۱-۱-۲ فرضيات. |
| ۵ | ۱-۱-۳ اهداف پژوهش. |
| ۵ | ۱-۱-۴ ساختارپژوهش. |
| ۶ | ۱-۲ كليات |
| ۶ | ۱-۲-۱ گياه شناسي |
| ۷ | ۱-۲-۲ رويش و تكثير گياه |
| ۷ | ۱-۲-۳ خواستگاه و دامنه انتشار. |
| ۷ | ۱-۲-۴ نيازهاي اكولوژي |
| ۸ | ۱-۲-۵ اهميت دارويي. |
| ۸ | ۱-۲-۶ مواد موثره و اجزاء اسانس. |
| ۹ | ۱-۲-۷ استفاده‌ها |
| ۹ | ۱-۲-۸ كشت بافت گياهي. |
| ۱۱ | ۱-۲-۸-۱ تاريخچه كشت بافت گياهي |
| ۱۲ | ۱-۲-۹ كاربردهاي كشت بافت گياهي |
| ۱۲ | ۱-۲-۹-۱ توليد مواد شيميايي |
| ۱۲ | ۱-۲-۹-۲ ايجاد گياه عاري از عوامل بيماري‌زاي گياهي |
| ۱۲ | ۱-۲-۹-۳ ايجاد تنوع ژنتيكي. |
| ۱۲ | ۱-۲-۹-۴ كاربرد كشت بافت گياهي در كشاورزي،باغباني و جنگل‌داري |
| ۱۳ | ۱-۲-۹-۵ كاربردهاي اقتصادي كشت بافت گياهي |
| ۱۳ | ۱-۲-۹-۶ كاربردهاي كشت بافت گياهي در مهندسي ژنتيك و فناوري زيستي. |
| صفحه | عنوان |
| ۱۴ | ۱-۲-۹-۷ انواع كشت بافت گياهي |
| ۱۴ | ۱-۲-۹-۸ بررسي اثرات فاكتورهاي مختلف در محيط كشت |
| ۱۵ | ۱-۲-۹-۹ نمك‌هاي غيرآلي. |
| ۱۵ | ۱-۲-۹-۱۰ ويتامين‌ها. |
| ۱۶ | ۱-۲-۹-۱۱ هورمون‌هاي گياهي. |
| ۱۶ | ۱-۲-۹-۱۱-۱ اكسين‌ها |
| ۱۷ | ۱-۲-۹-۱۱-۲ سيتوكنين‌ها. |
| ۱۸ | ۱-۲-۹-۱۲ منبع انرژي. |
| ۱۸ | ۱-۲-۹-۱۳ عوامل فيزيكي. |
| ۱۸ | ۱-۲-۹-۱۴ مواد آلي. |
| ۱۹ | ۱-۲-۹-۱۵ ريزنمونه |
| ۱۹ | ۱-۲-۹-۱۶ PH. |
| ۱۹ | ۱-۲-۹-۱۷ آب |
| ۲۰ | ۱-۲-۹-۱۸ آگار. |
| ۲۰ | ۱-۲-۹-۱۹ چگونگي انتخاب محيط كشت |
| ۲۰ | ۱-۲-۱۰ ريزازديادي گياهان از طريق كشت بافت |
| ۲۱ | ۱-۲-۱۰-۱ موارد استفاده از ريزازديادي |
| ۲۲ | ۱-۲-۱۱ريشه‌زائي. |
| ۲۲ | ۱-۲-۱۲ تعريف موتاسيون (جهش). |
| ۲۲ | ۱-۲-۱۲-۱ تاريخچه استفاده از موتاسيون |
| ۲۳ | ۱-۲-۱۲-۲ انواع موتاسيون |
| ۲۳ | ۱-۲-۱۲-۳ موتاژن. |
| ۲۴ | ۱-۲-۱۲-۳-۱ انواع موتاژن |
| ۲۴ | ۱-۲-۱۲-۳-۲ عوامل شيميايي جهش‌زا |
| ۲۵ | ۱-۲-۱۲-۴ سطوح ايجاد موتاسيون |
| صفحه | عنوان |
| ۲۶ | ۱-۲-۱۲-۵ مواد گياهي مورد تيمار |
| ۲۶ | ۱-۲-۱۲-۶ اهميت موتاسيون در اصلاح نباتات. |
| ۲۶ | ۱-۲-۱۲-۷ هدف موتاسيون مصنوعي |
| ۲۷ | ۱-۲-۱۲-۸ موفقيت موتاسيون. |
| ۲۷ | ۱-۲-۱۲-۹ اصلاح به روش موتاسيون. |
| ۲۷ | ۱-۲-۱۲-۱۰ روش‌هاي جديد استفاده از موتاسيون. |
| ۲۸ | ۱-۲- ۱۳اسانس گياهي. |
| ۲۹ | ۱-۲-۱۳-۱روغن‌هاي اسانس. |
| ۳۰ | ۱-۲-۱۳-۲ جداسازي و شناسايي مواد تشكيل دهنده روغن اسانسي گياه. |
| فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده | |
| ۳۱ | ۲-۱ اثر موتاژن‌ها در ايجاد تنوع در صفات مختلف. |
| ۳۳ | ۲-۲ اثر موتاسيون اتيل متيل سولفانات در ايجاد تنوع در سطوح مختلف. |
| ۳۸ | ۲-۳ كشت بافت. |
| فصل سوم: مواد و روش‌ها | |
| ۴۰ | ۳-۱ مواد گياهي |
| ۴۰ | ۳-۲ كشت بافت. |
| ۴۰ | ۳-۲-۱ تهيه محلول ذخيره محيط‌هاي كشت |
| ۴۱ | ۳-۲-۱-۱ تهيه محلول ذخيره ماكرو. |
| ۴۱ | ۳-۲-۱-۲ تهيه محلول ذخيره عناصر ميكرو. |
| ۴۳ | ۳-۲-۱-۳ تهيه محلول ذخيره آهن-سديم |
| ۴۳ | ۳-۲-۱-۴ تهيه محلول ذخيره ويتامين |
| ۴۴ | ۳-۲-۲ تهيه محيط كشت |
| ۴۵ | ۳-۲-۳ كار در اتاقك كشت بافت. |
| ۴۶ | ۳-۲-۴ ضدعفوني وسايل آزمايشگاهي، محيط كشت و مواد گياهي |
| ۴۶ | ۳-۲-۴-۱ ضدعفوني نمونه‌هاي گياهي. |
| صفحه | عنوان |
| ۴۶ | ۳-۲-۳-۱ ضدعفوني اندام گياه |
| ۴۷ | ۳-۲-۵ تهيه ريزنمونه |
| ۴۷ | ۳-۲-۶ بهينه سازي محيط كشت |
| ۴۷ | ۳-۲-۷ بررسي نمونه‌هاي كشت شده |
| ۴۷ | ۳-۲-۸ بازيافت كشت‌هاي آلوده |
| ۴۸ | ۳-۲-۹ تيمارهاي مورد استفاده. |
| ۴۸ | ۳-۲-۹-۱ روش تهيه استوك EMS |
| ۴۹ | ۳-۲-۹-۲ روش اعمال تيمارهاي EMS در گياه كشت بافتي. |
| ۴۹ | ۳-۲-۹-۳ روش اعمال تيمارهاي EMS در مزرعه. |
| ۵۰ | ۳-۲-۹-۴ روش شستشوي تيمارها |
| ۵۰ | ۳-۳ تهيه مواد گياهي براي اسانس‌گيري. |
| ۵۰ | ۳-۴ آناليز اجزاء اسانس |
| ۵۱ | ۳-۵ تجزيه داده‌هاي آماري. |
| فصل چهارم: نتايج و بحث | |
| ۵۲ | ۴-۱ كشت بافت. |
| ۵۵ | ۴-۲ تاثير EMS برروي خصوصيات مرفولوژيكي گياه. |
| ۵۶ | ۴-۲-۱ ضريب همبستگي بين صفات و خصوصيات مورد بررسي |
| ۵۶ | ۴-۲-۲ اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد ريشه جانبي |
| ۵۷ | ۴-۲-۳ اثر دوز EMS و زمان برروي طول ريشه |
| ۵۷ | ۴-۲-۴ اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد ريشه. |
| ۵۸ | ۴-۲-۵ اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد برگ |
| ۵۸ | ۴-۲-۶ اثر دوز EMS و زمان برروي تعداد جوانه |
| ۵۹ | ۴-۲-۷ اثر دوز EMS و زمان برروي طول ساقه. |
| ۶۰ | ۴-۲-۸ اثر دوز EMS و زمان برروي متوسط طول برگ |
| ۶۰ | ۴-۳ استخراج اسانس |
| صفحه | عنوان |
| ۶۰ | ۴-۳-۱ آناليز و شناسايي كمي و كيفي اجزاي موجود در اسانس |
| ۶۱ | ۴-۳-۲ نتايج مربوط به طيف كروماتوگرام گازي گياه |
| ۶۲ | ۴-۳-۳ تركيبات تشكيل دهنده اسانس. |
| فصل پنجم: نتيجه‌گيري | |
| ۶۳ | ۵-۱ بحث. |
| ۶۳ | ۵-۱-۱ كشت بافت گياهي. |
| ۶۴ | ۵-۱-۲ اثرات موتاژن EMS |
| ۶۸ | ۵-۲ نتيجه‌گيري |
| ۶۹ | ۵-۳ پيشنهادات. |
| ۷۰ | فهرست منابع فارسي. |
| ۷۴ | فهرست منابع انگليسي |
| ۸۶ | چكيده انگليسي. |
چكيده
بادرنجبويه با نام علمي Melissa officinalis يكي از انواع گياهان دارويي مي‌باشد كه به دليل توليد اسانس‌هاي با ارزش در صنايع داروسازي و بهداشتي استفاده‌هاي فراواني دارد. اين پژوهش با قرار دادن ريز نمونه‌هاي بادرنجبويه به محيط كشت درون شيشه‌اي MS انجام شد و هدف تكثير گياه از طريق كشت بافت براي استفاده از تاثير موثرتر ماده جهش‌زا و بدست آوردن نمونه‌هاي گياهي جديد موتانت شده هم از طريق كشت بافت و هم در محيط مزرعه و بررسي تغييرات ميزان مواد موثره اسانس موجود در گياه در اثر ماده جهش‌زاي اتيل متيل سولفانات (EMS) مي‌باشد. اين آزمايش هم بصورت مزرعه‌اي و هم بصورت آزمايشگاهي (كشت بافتي) مورد بررسي قرار گرفت. در تيمارهاي آزمايشگاه، سرشاخه‌هاي رشد يافته در محيط MS بدون هورمون را با غلظت‌هاي ۰/۰% (به عنوان شاهد)، ۰۵/۰% و ۰۱/۰% و ۰۰۵/۰% EMS و در مدت زمان‌هاي ۲۴ و۴۸ ساعت اعمال شدند. در قسمت مزرعه‌اي نيز از همين غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شدند. فاكتورهاي مختلف مورفولوژيك از قبيل طول ساقه، طول ريشه، تعداد جوانه در ساقه، تعداد ريشه رونده جانبي، طول برگ و تعداد برگ در ساقه مورد ارزيابي قرار گرفته و پاسخ معني‌داري را در سطح ۵ درصد نشان دادند اين آزمايش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محيط كشت MS نقش بسزايي در تغيير مرفولوژيك اين گياه دارويي دارد. بهترين نتيجه نيز از كشت ريزنمونه‌هاي كه شامل جوانه‌هاي جانبي و انتهايي بوده‌اند و تحت تيمار با غلظت ۰۱/۰% EMS بودند به‌دست آمد. آناليز اسانس تيمارها نيز انجام شد كه نتيجه آن بي‌اثر بودن اين ماده اتيل متيل سولفانات روي مواد اجراء اسانس اين گياه بوده است.
كلمات كليدي: بادرنجبويه (Melissa officinalis)، كشت درون شيشه‌اي، محيط كشت MS، اتيل متيل سولفانات(EMS)، مواد موثره
۱-۱ مقدمه:
گياهان دارويي فراواني در كشور ما مي‌رويند كه بسياري از آنها داراي طيف وسيعي از خواص دارويي مي‌باشند و در بسياري از نقاط كشور رشد مي‌يابند. برهمين اساس بررسي و مطالعه گياهان دارويي ايران با بهره گرفتن از ابزارهاي امروزي ضروري به نظر مي‌رسد. در حال حاضر در قرن ۲۱، طب گياهي از جايگاه خاصي برخوردار است به گونه‌اي كه در اتحاديه اروپا قوانيني مبني بر لزوم انجام آزمايشات باليني برروي گياهان دارويي همانند داروهاي شيميايي وضع كرده است كه بر اساس آن تمام داروهاي گياهي بايد مجوز دريافت نمايند. اولين استفاده از گياهان دارويي در خاورميانه و مربوط به عصر پارينه سنگي است. شواهد استفاده از گياهان دارويي توسط انسان به حدود شصت هزار سال پيش مي‌رسد.
گياهان به عنوان يكي از اجزاء طبيعت، از ديرگاه پشتوانه غني نيازهاي بشري بوده‌اند و مي‌توان با اطمينان گفت تا زماني كه انسان در اين كره خاكي به سر مي‌برد، به گياهان نياز دارد (سليمان زاده، ۱۳۷۷).
در بحث گياهان دارويي، محدوديت‌هاي كاشت و نگهداري آنها متعدد مي‌باشد كه از آن جمله مي‌توان به كوتاه بودن فصل كاشت و يا برداشت بعضي از گونه‌هاي گياهي، كمبود زمين‌هاي مناسب جهت داشت، ناچيز بودن مواد موثره حاصل از گياه و غيره اشاره كرد (ثقه الاسلام و موسوي، ۱۳۸۵).
يكي از راه‌هاي رفع اين محدوديت‌ها كشت بافت گياهي[۱] است. تكنيك‌هاي كشت بافت گياهي درحال حاضر به عنوان يك ابزار قوي جهت رفع مشكلات اساسي و كاربردي بيولوژي گياهي درآمده است.
استفاده از گياهان به عنوان دارو از زمان‌هاي خيلي دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود يك سوم داروهاي مورد استفاده داراي منشاء گياهي مي‌باشند. كشورهاي آسيايي بخصوص هند، چين و ايران سابقه بسيار طولاني دراين زمينه دارند. اين گياهان مواد زيستي بخصوص و فعال با مقادير بسيار كم توليد مي‌كنند كه تحت عنوان متابوليت‌هاي ثانويه نام‌گذاري مي‌شوند.در عصر جديد، دانشمندان علوم گياهي با بهره گرفتن از آخرين تكنيك‌هاي عملي كشت بافت گياهي، توانسته‌اند از انواع گياهان تركيب‌هاي بسيار مفيدي را جهت مداواي بيماري‌هاي سخت و غير قابل مداوا و موارد استفاده ديگر، بدست آورند. در طي چند دهه اخير روش‌هاي متفاوتي با بهره گرفتن از بيوتكنولوژي[۲] درزمينه پرورش محصولات گياهي برتر ابداع شده است كه از جمله آنها مي‌توان روش‌هاي ايجاد گونه‌هاي جهش يافته[۳] و پلي پلوئيد[۴] را نام برد.
كشت سلول و بافت كه به عنوان كشت درون شيشه‌اي[۵] و يا كشت استريل نيز مطرح مي‌شود، ابزاري مهم در مطالعات پايه و كاربردي بوده و داراي كاربردهاي تجاري است (رجب بيگي و همكاران، ۱۳۸۵؛ سونانداكوماري و همكاران[۶]، ۲۰۰۳). يكي از اين كاربردها امكان ايجاد گياهان ترانسژنيك با وارد كردن DNA تقريبا از هر منبع ديگري مي‌باشد. شايد اولين قدم در زمينه كشت بافت گياهي در سال ۱۷۵۶ توسط هنري لوئيس داهامل برداشته شد، زماني كه وي شاهد تشكيل كالوس[۷] در حين مطالعه مواد التيام دهنده زخم‌هاي گياهي بود (غضنفري[۸]، ۱۹۹۴).
اساس تئوري كشت بافت گياهي توسط گتليت هابرلنت از آكادمي علوم آلمان در سال ۱۹۰۲، بعد از آزمايش هاي وي روي كشت تك سلول ها پيشنهاد گرديد (هابرلنت[۹]، ۱۹۰۲). توسعه روش‌هاي كشت بافت و زيست‌شناسي مولكولي براي تبادل DNA بين موجودات زنده غير خويشاوند اين امكان را مي‌دهد كه ژن‌هاي جديدي از موجودات زنده خارج از سلسله گياهي به درون گياهان گيرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر مي‌تواند كمكي جهت بررسي و واكنش‌هاي گياه بادرنجبويه نسبت به تكنيك‌هاي مختلف كشت بافت و باززائي اين گياه از طريق كشت بافت و اثر مواد جهش‌زائي همچون اتيل متيل سولفانات[۱۰] (EMS) باشد، تا محققين ديگر بتوانند به مطالعه خواص دارويي يا تغييرات لازم در مواد موثره يا فعال (متابوليت‌هاي ثانويه) و يا مطالعات انتقال ژن در اين گياه بپردازند.
۱-۱-۱ اهميت موضوع
براي انجام كشت بافت بادرنجبويه (Melissa officinalis L) از بخش‌هاي مختلف گياه مانند ريشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداكوماري و همكاران، ۲۰۰۳؛ ساجانا و همكاران[۱۱]، ۲۰۱۱). با توجه به اينكه روش معمول اصلاح و بهبود توليد متابوليت‌هاي ثانويه در گياهان دارويي شامل كاشت آنها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج اين مواد به روش‌هاي شيميايي و غيره با مشكلات متعددي نظير شرايط محيطي و زراعي، صرف زمان، هزينه و استفاده نيروي كار زياد و همچنين خطرنابودي برخي از گياهان دارويي كمياب روبرو است، استفاده از روش‌هاي نوين از جمله كشت درون شيشه‌اي (in vitro) ضرورت مي‌يابد به همين منظور اولين بار در سال ۱۹۷۶ توسط زنيك تكنيك كشت سوسپانسيون سلول هاي گياهي حاوي متابوليت‌هاي ثانويه انجام گرفت. البته در ارتقاء بيوسنتز متابوليت‌هاي دارويي در شرايط درون شيشه‌اي اغلب، گياهاني انتخاب مي‌شوند كه بازده توليد متابوليت‌هاي با ارزش در آنها بالا باشد (باقري و صفاري، ۱۳۸۷).
بادرنجبويه به عنوان يك گياه دارويي شناخته مي‌شود (اميدبيگي ،۱۳۸۶؛ هوشيار قيصر،۱۳۸۸). تاكنون مطالعات زيادي در مورد تعيين مواد موثره بادرنجبويه صورت گرفته است (رجحان،۱۳۶۲؛ زرگري،۱۳۶۹؛ مومني وشاهرخي،۱۳۷۷؛ آزادبخت،۱۳۷۸). موارد مصرف و خواص دارويي آن نيز به خوبي مطالعه شده است اما مطالعات كشت بافت و ايجاد جهش زياد نبوده است. همچنين با در نظر گرفتن اهميت و خواص دارويي اين گياه، مطالعات كشت بافت، بهينه‌سازي محيط كشت جهت اهداف مختلف، مطالعه متابوليت‌هاي ثانويه ،انتقال ژن و مهندسي ژنتيك براي اين گياه ضرورت دارد.
۱-۱-۲ فرضيات
* كشت بافت يكي از راه‌هاي سريع در ازدياد انبوه بادرنجبويه مي‌باشد.
* بادرنجبويه در محيط كشت همواره در دسترس براي اعمال هر گونه اعمال تيمار از قبيل جهش مي‌باشد.
* ايجاد جهش تا چه ميزاني مي‌تواند بر روي مواد موثره و ميزان اسانس تغيير ايجاد نمايد.
۱-۱-۳ اهداف پژوهش
در اين پژوهش تلاش مي شود اهداف زير دنبال شود
*آشنايي با تكنيك كشت بافت گياه دارويي بادرنجبويه و تكثير آن در داخل شيشه.
* انتخاب بهترين و مناسب‌ترين نوع از انواع مخيط‌هاي مختلف كشت بافت
* بدست آوردن مقدار قابل توجه گياه در حال رشد براي اعمال جهش نقطه‌اي در بادرنجبويه.
*بررسي تغييرات در خصوصيات مورفولوژيكي پس از اعمال جهش در گياه بادرنجبويه.
* بررسي تغيير در ميزان مواد موثره گياه در غلظت‌هاي مختلف ماده جهش‌زاي EMS
۱-۱-۴ ساختار پژوهش
پژوهش حاضر در پنج فصل ارائه شده است. در فصل اول بيان كلي مسئله، هدف پژوهش و دلايل اهميت موضوع، گياه شناسي بادرنجبويه و خصوصيات مختلف آن مي‌پردازد. همچنين مباحث مربوط به كشت بافت، تاريخچه و كاربرد آن و فاكتورهاي موثر در كشت بافت به دقت مورد بررسي قرار مي‌گيرد. در ادامه، مطالب مربوط به ايجاد جهش و اسانس‌گيري آن مطرح شده و در اين ميان به پژوهش‌هاي پيشين نيز اشاره خواهد شد.
فصل دوم شامل مروري بر تحقيقات و كارهاي پژوهشي انجام شده در رابطه با كشت بافت و اعمال موتاژن‌ها بر روي گياهان است.
فصل سوم شامل مواد و روش‌هاي مورد استفاده در پژوهش از جمله چگونگي ساخت محيط كشت MS و ويژگي‌هاي هر كدام از مواد مورد استفاده دراين محيط است. همچنين در ادامه به روش ضدعفوني كردن گياه، تهيه ريزنمونه و چگونگي كشت كردن اشاره خواهد شد. روش اسانس‌گيري از گياه نيز در اين فصل مورد بررسي قرار خواهد گرفت.
فصل چهارم به بيان نتايج بدست آمده از محاسبه آناليزهاي آماري نمونه‌هاي كشت شده و تحت تيمار قرار گرفته با غلظت‌هاي مختلف مي‌پردازد.
فصل پنجم شامل چكيده‌اي از نتايج حاصل از اين تحقيق و استدلال و بحث در مورد آنها مي‌باشد و همچنين پيشنهادهايي در مورد كارهاي آتي ارائه مي‌دهد.