دانشگاه آزاد اسلامي

واحد دامغان

دانشكده‌كشاورزي

 پايان نامه براي دريافت درجه كارشناسي ارشد

رشته مهندسي كشاورزي (بيوتكنولوژي كشاورزي)

گرايش كشاورزي

عنوان

توليد موتاسيون در گياه نعناع فلفلي با بهره گرفتن از موتاژن EMS

استاد راهنما

دكترسيدكمال كاظمي‌تبار

استاد مشاور

دكترجعفرمسعودسينكي

 
تكه هايي از متن به عنوان نمونه :

چكيده
نعناع فلفلي با نام علمي Mentha piperitaيكي از انواع گياهان دارويي مي‌باشد كه به دليل توليد اسانس‌هاي با ارزش در صنايع داروسازي و بهداشتي استفاده‌هاي فراواني دارد. استفاده از مواد موتاسيون‌زا از قبيل EMS مي‌تواند تغييرات جهش‌زاي نقطه‌اي در گياه ايجاد كند كه در نهايت منجر به ظهور فنوتيپ جديد در اين گياه با ارزش شويد. لذا اين پژوهش با انجام تيمارهاي متعدد از غلظت‌هاي مختلف EMS روي سرشاخه‌هاي رشد يافته در محيط كشت MS بدون هورمون و با غلظت‌هاي ۰/۰% (به عنوان شاهد)، ۰۵/۰% و ۰۱/۰% و ۰۰۵/۰% از EMS و مدت زمان‌هاي مختلف (۲۴ و۴۸ ساعت) و همچنين در قسمت مزرعه‌اي نيز از همين غلظت‌ها و زمان‌ها استفاده شد. ارزيابي‌ در داخل لوله آزمايش و مزرعه بطور همزمان انجام گرفت. پس از انتفال و رشد و نمو نمونه‌ها در شرايط in vitro، تيمارها با ماده جهش‌زا اتيل متان سولفانات مورد بررسي قرار گرفتند. فاكتورهاي مختلف مورفولوژيكي از قبيل طول ساقه و تعداد ريشه رونده جانبي در سطح ۱% و تعداد برگ و تعداد جوانه در ساقه در سطح ۵% پاسخ معني‌داري را نشان دادند. نتايج اين پژوهش نشان داد كه استفاده از مواد جهش‌زا در محيط كشت MS نقش بسزايي در تغيير فنوتيپي اين گياه دارويي دارد. غلظت ۰۱/۰% EMS بهترين نتيجه معني‌دار را در سطح ۱% و از كشت ريزنمونه‌هاي كه شامل جوانه‌هاي جانبي و انتهايي بوده‌اند به‌دست آورده كه برروي خصوصياتي همچون طول ساقه، تعداد برگ و تعداد جوانه جانبي اثر داشت. آناليز اسانس تيمارها نيز انجام شد كه نتيجه آن بي‌اثر بودن اين ماده اتيل متان سولفانات روي مواد اجراء اسانس اين گياه بوده است.
كلمات كليدي: اتيل متيل سولفانات (EMS)، اجزاء اسانس، كشت درون شيشه‌اي، محيط كشت MS، نعناع فلفلي (Mentha piperita).
۱-۱ مقدمه:
گياهان به عنوان يكي از اجزاء طبيعت، از ديرگاه پشتوانه غني نيازهاي بشري بوده‌اند و مي‌توان با اطمينان گفت تا زماني كه انسان در اين كره خاكي به سر مي‌برد، به گياهان نياز دارد (سليمان زاده، ۱۳۷۷).
در بحث گياهان دارويي، محدوديت‌هاي كاشت و نگهداري آن‌ها متعدد مي‌باشد كه از آن جمله مي‌توان به كوتاه بودن فصل كاشت و يا برداشت بعضي از گونه‌هاي گياهي، كمبود زمين‌هاي مناسب جهت داشت، ناچيز بودن مواد موثره حاصل از گياه و غيره اشاره كرد (ثقه الاسلام و موسوي، ۱۳۸۵).
يكي از راه‌هاي رفع اين محدوديت‌ها كشت بافت گياهي[۱] است. تكنيك‌هاي كشت بافت گياهي درحال حاضر به عنوان يك ابزار قوي جهت رفع مشكلات اساسي و كاربردي بيولوژي گياهي درآمده است.
استفاده از گياهان به عنوان دارو از زمان‌هاي خيلي دور در معالجه انسان و دام مرسوم بوده است. در حال حاضر حدود يك سوم داروهاي مورد استفاده داراي منشاء گياهي مي‌باشند. كشورهاي آسيايي بخصوص هند، چين و ايران سابقه بسيار طولاني در اين زمينه دارند. اين گياهان مواد زيستي بخصوص و فعال با مقادير بسيار كم توليد مي‌كنند كه تحت عنوان متابوليت‌هاي ثانويه نام‌گذاري مي‌شوند. در عصر جديد، دانشمندان علوم گياهي با بهره گرفتن از آخرين تكنيك‌هاي عملي كشت بافت گياهي، توانسته‌اند از انواع گياهان تركيب‌هاي بسيار مفيدي را جهت مداواي بيماري‌هاي سخت و غير قابل مداوا و موارد استفاده ديگر، بدست آورند. در طي چند دهه اخير روش‎هاي متفاوتي با بهره گرفتن از بيوتكنولوژي[۲] درزمينه پرورش محصولات گياهي برتر ابداع شده است كه از جمله آن‌ها مي‌توان روش‌هاي ايجاد گونه‌هاي جهش يافته[۳] و پلي پلوئيد[۴] را نام برد.
گياهان دارويي فراواني در كشور ما مي‌رويند كه بسياري از آن‌ها از جمله نعناع فلفلي داراي طيف وسيعي از خواص دارويي مي‌باشند. برهمين اساس بررسي و مطالعه گياهان دارويي ايران با بهره گرفتن از ابزارهاي امروزي ضروري به نظر مي‌رسد. كشت سلول و بافت كه به عنوان كشت درون شيشه‌اي[۵] و يا كشت استريل نيز مطرح مي‌شود، ابزاري مهم در مطالعات پايه و كاربردي بوده و داراي كاربردهاي تجاري است (رجب‌بيگي و همكاران، ۱۳۸۵؛ سونانداكوماري و همكاران[۶]، ۲۰۰۳). يكي از اين كاربردها امكان ايجاد گياهان ترانسژنيك با وارد كردن DNA تقريبا از هر منبع ديگري مي‌باشد. شايد اولين قدم در زمينه كشت بافت گياهي در سال ۱۷۵۶ توسط هنري لوئيس داهامل برداشته شد، زماني كه وي شاهد تشكيل كالوس[۷] در حين مطالعه مواد التيام دهنده زخم‌هاي گياهي بود (غضنفري[۸]، ۱۹۹۴).
اساس تئوري كشت بافت گياهي توسط گتليت هابرلنت از آكادمي علوم آلمان در سال ۱۹۰۲، بعد از آزمايش‌هاي وي روي كشت تك سلول‌ها پيشنهاد گرديد (هابرلنت[۹]، ۱۹۰۲). توسعه روش‌هاي كشت بافت و زيست‌شناسي مولكولي براي تبادل DNA بين موجودات زنده غير خويشاوند اين امكان را مي‌دهد كه ژن‌هاي جديدي از موجودات زنده خارج از سلسله گياهي به درون گياهان گيرنده وارد شوند. لذا مطالعه حاضر مي‌تواند كمكي جهت بررسي و واكنش‌هاي گياه نعناع فلفلي نسبت به تكنيك‌هاي مختلف كشت بافت و باززائي اين گياه از طريق كشت بافت و اثر مواد جهش‌زائي همچون اتيل متان سولفانات[۱۰] (EMS) باشد، تا محققين ديگر بتوانند به مطالعه خواص دارويي يا تغييرات لازم در مواد موثره يا فعال (متابوليت‌هاي ثانويه) و يا مطالعات انتقال ژن در اين گياه بپردازند.
۱-۱-۱ اهميت موضوع
براي انجام كشت بافت نعناع فلفلي (Mentha piperita) از بخش‌هاي مختلف گياه مانند ريشه، برگ، ساقه و گره استفاده شد (سونانداكوماري و همكاران، ۲۰۰۳؛ ساجانا و همكاران[۱۱]، ۲۰۱۱). با توجه به اينكه روش معمول اصلاح و بهبود توليد متابوليت‌هاي ثانويه در گياهان دارويي شامل كاشت آن‌ها در مزرعه و سپس برداشت و استخراج اين مواد به روش‌هاي شيميايي و غيره با مشكلات متعددي نظير شرايط محيطي و زراعي، صرف زمان، هزينه و استفاده نيروي كار زياد و همچنين خطرنابودي برخي از گياهان دارويي كمياب روبرو است، استفاده از روش‌هاي نوين از جمله كشت درون شيشه‌اي (in vitro) ضرورت مي‌يابد به همين منظور اولين بار در سال ۱۹۷۶ توسط زنيك تكنيك كشت سوسپانسيون سلول‌هاي گياهي حاوي متابوليت‌هاي ثانويه انجام گرفت. البته در ارتقاء بيوسنتز متابوليت‌هاي دارويي در شرايط درون شيشه‌اي اغلب، گياهاني انتخاب مي‌شوند كه بازده توليد متابوليت‌هاي با ارزش در آن‌ها بالا باشد (باقري و صفاري، ۱۳۸۷).
نعناع فلفلي به عنوان يك گياه دارويي شناخته مي‌شود (اميدبيگي، ۱۳۸۴،۱۳۸۹). تاكنون مطالعات زيادي در مورد تعيين مواد موثره نعناع فلفلي صورت گرفته است (كاظم الوندي و شريفان، ۱۳۸۸). موارد مصرف و خواص دارويي آن نيز به خوبي مطالعه شده است اما مطالعات كشت بافت و ايجاد جهش زياد نبوده است. با توجه به اينكه تكثير اين گياه از طريق بذر مشكل است (بدليل بذور كم و نابارور)، بهترين و سريع‌ترين راه براي داشتن گياه جهت مصارف صنعتي، كشت بافت است. همچنين با در نظر گرفتن اهميت و خواص دارويي اين گياه، مطالعات كشت بافت و بهينه‌سازي محيط كشت جهت اهداف مختلف براي اين گياه ضرورت دارد.
۱-۱-۲ فرضيات
۱- كشت بافت يكي از راه‌هاي سريع در ازدياد انبوه نعناع فلفلي مي‌باشد.
۲- نعناع فلفلي در محيط كشت همواره در دسترس براي اعمال هر گونه اعمال تيمار از قبيل جهش مي‌باشد.
۳- ايجاد جهش نقطه­اي تا چه ميزاني مي‌تواند بر روي مواد موثره و ميزان اسانس تغيير ايجاد نمايد.
۱-۱-۳ اهداف پژوهش