دانشگاه آزاد اسلامي

واحد دامغان

دانشكده علوم پايه

 پايان‌نامه براي دريافت درجه كارشناسي ارشد(M.sc) رشته زيست شناسي علوم جانوري

گرايش فيزيولوژي جانوري  

 عنوان:

ارتباط پلي مورفيسم TaqI گيرنده ويتامين D  با سرطان پستان در شمال ايران

 استاد راهنما:

جناب آقاي دكتر غلامحسن واعظي

 استاد مشاور:

جناب آقاي دكتر سهراب حلال‌خور

 
تكه هايي از متن به عنوان نمونه :
چكيده
مقدمه: سرطان پستان شايع ترين سرطان در بين زنان است كه هزينه‌هاي سنگيني را به بيمار و جامعه تحميل مي‌كند.بنابراين بررسي فاكتورهايي كه ما را در پيش‌آگاهي و تشخيص كمك كند، بسيار ارزنده خواهد بود. از جمله اين فاكتورها بررسي‌هاي ژنتيكي مي‌باشد. وپژوهش هاي زيادي نشان داده اند كه سطح ويتامينD رابطه معكوس با ميزان ابتلا و پيشرفت بيماري دارد و از آنجا كه گيرنده ويتامين Dيعني VDR واسطه اثرات ضد سرطاني ويتامينD مي‌باشد، لذا بررسي پلي‌مورفيسم‌ هاي ژن گيرنده مي‌تواند كمك زيادي در شناسايي ارتباط ميان اين ژن و سرطان پستان بنمايد.
مواد و روش كار: در اين مطالعه اثر پلي‌مورفيسمTaqI ژن VDR در احتمال بروز بيماري در ميان جمعيت زنان مازندراني بررسي شده و همچنين سطح سرمي ويتامينD در اين جمعيت اندازه‌گيري شد.در اين مطالعه مورد – شاهدي دو گروه از زنان شامل گروه مبتلا به سرطان پستان و گروه سالم انتخاب شدند واز آنها دو نمونه شامل خون تام (جهت استخراج DNA) و سرم (براي اندازه‌گيري سطح ويتامينD ) تهيه شد. ابتدا سطح سرمي ويتامينD باروش كمي لومينسانس اندازه‌گيري شد و سپس قطعات ژني مربوط به پلي‌مورفيسم TaqI بر روي ژن VDR با روش PCR تكثير شد و ژنوتيپ آن ها تعيين گرديد.
نتايج:ميانگين سطح سرمي ويتامينD در افراد بيمار۴۸۱۴/۱±۴۱۲/۱۳ميكروگرم بر دسي ليتر و در افراد كنترل ۸۷۸۰/۱±۷۷۱/۱۹ميكروگرم بر دسي ليترتعيين شد وبين سطح سرمي ويتامينD با بيماري ارتباط معنا دار ديده شد (۰۱/۰=P).فراواني الل هاي t وT در هر دو گروه تقريبا يكسان بوده است مقدار P براي الل Tو t 634/0 اندازه گيري شد . بررسي نسبت شانس نشان داد كه احتمال ابتلا به سرطان پستان در افراد با ژنوتيپ tt تقريباً ۱۸/۱ برابر مي‌باشد.
نتيجه گيري: اين مطالعه نشان داد كه ارتباط بين پلي‌مورفيسم TaqIبا بروز سرطان پستان معني‌دار نيست ولي ارتباط كاهش سطح ويتامينD با افزايش احتمال ابتلا به اين سرطان كاملاً معني‌دار است.
كليد واژه :
سرطان پستان ، پلي‌مورفيسمTaqI ، ژن گيرنده ويتامينD (VDR) ، ويتامينD
مقدمه:
سرطان پستان بيماري شايعي است كه حدود۱۰% كل انواع سرطان ها را در جمعيت زنان ومردان تشكيل مي دهد و دومين سرطان شايع پس از سرطان ريه مي باشدو۲۲% انواع سرطان را دربين زنان شامل مي شود   ) آسوس و دلگادو^۱ ،۲۰۰۵; حميدي و همكاران^۲،۲۰۰۳).
در حدود پنج تا ده درصد از سرطان ها به طور كامل ارثي هستند.سرطان را مي توان باروش هاي متعددي ، از جمله حضور علائم خاص و آزمايش هاي غربالگري، يا تصويربرداري پزشكي تشخيص داد،هنگامي سرطان قابل تشخيص است كه با بررسي ميكروسكوپي از نمونه بافت تشخيص داده شود.سرطان معمولا با شيمي درماني، پرتو درماني و عمل جراحي درمان مي شود .اماشانس زنده ماندن در اين بيماري بسيار متفاوت است .نوع ، محل سرطان و ميزان بيماري در شروع درمان مهم است.با وجود اين سرطان مي تواند افراد را در همه سنين تحت تاثير قرار دهد ،اما خطر ابتلا به سرطان به طور كلي، با بالا رفتن سن افزايش مي يابد.
در سال ۲۰۰۷ سرطان عامل مرگ ومير۱۳ درصد از بشربوده است و در سرتاسر جهان نرخ سرطان به خصوص دركشورهاي در حال توسعه وابسته به سن و تغيير در شيوه زندگي جمعي روبه افزايش است (جمال و همكاران^۳،۲۰۱۱).
به دليل فراگيربودن اين بيمارى تحقيقات زيادى براى شناسايى علت ايجاد اين بيمارى صورت گرفته است كه براساس آنها از جمله عواملى كه باايجادسرطان پستان مي تواند مرتبط باشد عبارتست از:
افزايش سن، بروز اولين دوره قاعدگى قبل از ۱۳ سالگي و يائسگى پس از ۵۱ سالگي ،زادوولد و شير دهي ،اشعه به قفسه سينه و يا صورت قبل از سن ۳۰ سالگي،داشتن اضافه وزن، نوشيدن الكل، عدم ورزش، استعمال دخانيات ، نسبت قد به وزن (BMI)، استفاده از منابع خارجى استروژنى، سطح برخى هورمون هاى آندوژن،عوامل ژنتيكي، سابقه خانوادگى سرطان پستان وسابقه بيماري هاى خوش- خيم پستان را مي توان نام برد. همچنين مصرف مواد غذايي گياهي و حيواني) خن و همكاران^۴،۲۰۱۰).
ويتامين D علاوه بر نقشش در هموستازي كلسيم و سلامتي استخوان به عنوان يك عامل ضدسرطاني نيز شناخته شده است.كه در مقابله با بسياري از سرطان ها از جمله سرطان پستان فعالانه عمل مي كند ( شاو و همكاران^۵،۲۰۱۲).
ويتامين D اثرات ضدسرطاني خود را با واسطه گيرنده اش VDRو رونويسي از ژن هاي هدف (مانند BRCA1 ، P53 و غيره ) اعمال مي كند( آنگ و همكاران^۱ ،۲۰۰۹).
بنابراين بررسي ويتامين D به عنوان يك عامل بالقوه موثر در كاهش ابتلا و نيز درمان سرطان پستان ضروري به نظر مي رسد.
بيان مسأله:
سرطان پستان جزء ژنتيكي  قوي دارد،بطوريكه خطر بروز سرطان پستان براي خانمي با يك ويا بيش از يك خويشاوند درجه يك  مبتلا به اين سرطان،به ترتيب سه و ده برابر مي باشد(نوسبايوم و همكاران^۲ ،۲۰۰۱).
بر اساس رفرنس ديگري خطر بروز سرطان  پستان براي زنان تا سن ۸۰ سالگي نداشتن هيچ خويشاوند درجه يك مبتلا به اين سرطان ۸/۷%و براي زنان بايك و يا دو خويشاوند درجه يك مبتلا ، به ترتيب ۱۳%و ۲۱%خواهدبود ( حميدي و همكاران،۲۰۰۳).
تاثير ويتامين D وگيرنده اش (VDR) بر عملكرد چرخه سلولي تا حدودي نشان داده كه فرم فعال ويتامين  D   يعني ۱,۲۵(OH)₂ D₃ تنظيم كننده بالقوه اي در كنترل رشد و تمايز سلولي مي باشدو شواهد اخير نشان مي دهند كه در مرگ سلولي،تهاجم توموري و رگ زايي نيز نقش بسزائي دارد، طوري كه مي توان گفت در تنظيم بروز و  پيشرفت سرطان نقش دارد. مسير كلاسيك سنتز ۱,۲۵(OH)₂D₃ شامل هيدروكسيلاسيون موقعيت هاي ۱و 25 ويتامين D3 جذب شده از طريق روده و يا ساخته شده در پوست،به ترتيب به كبد و كليه منتقل و تبديل به فرم فعال D3 مي شود.اما اخيراًً كنترل متابوليسم موضعي ۱,۲۵(OH)₂D₃در بافت ها توسط هيدروكسيلازهاي بافتي به خصوص در ﺁنزيم  كاتابوليزه كننده اصلي يعني۲۴- هيدروكسيلاز مورد توجه قرارگرفته است.مسير كلاسيك سيگنالينگ۱,۲۵(OH)₂D₃  باواسطه VDR كه نوعي فاكتور نسخه برداري براي ژن هاي هدف ۱,۲۵(OH)₂D₃ است، صورت مي  گيرد.
اثرات اين مسير شامل مهار رشد سلولي و نيز مهار تهاجم توموري است . مسير هاي سيگنالينگ  سيتوپلاسمي كه به طور روز افزوني در حال شناسايي هستند نيز احتمالا در كنترل رشد و تمايز سلولي نقش  دارند،اما اين مسيرها در مرگ سلولي نيز نقش دارند. ۱,۲۵(OH)2D3 داراي اثرات مهار كنندگي مهمي بر  G1/S Checkpoint سيكل سلولي با افزايش بيان مهار كننده هاي كينازي وابسته به سايكلين هاي P27 و  P21 و نيز با مهار سيكلين D1 است.
ممكن است كه موجب القا مرگ سلولي يا به طور غير مستقيم از طريق اثر بر روي گيرنده رشد شبه انسوليني و فاكتور آلفاي نكروز توموري و يا به طور مستقيم از طريق سيستم خانواده Bcl-2 ، مسير سرﺁميد،گيرنده هاي مرگ(به عنوان مثال Fas ) و مسير هاي پروتيين كينازي فعال شده توسط استرس(P38 و كيناز N ترمينال Jun) شود. اثر مهاركننده گي 1,25(OH)₂D₃ بر تهاجم و متاستاز توموري نشان داده شده و مكانيسم آن شامل مهار سرين پروتئيناز ها،متالو پروتئينازها و رگ زايي است. مدارك دال بر اثر ويتامين D₃ بر سرطان شامل شواهدآزمايشگاهي  مبني بر تاثير ويتامين D₃ بر رشد سلولي،تمايز سلولي،مرگ سلولي،تهاجم ومتاستاز توموري، و نيز شواهد اپيدميولوژيكي درارتباط با همبستگي بين وقوع و ميزان پيشرفت سرطان با اختلال در متابوليسم ويتامين D₃ و برخي از پلي مورفيسم هاي ژن VDR است.ضمنا آنالوگ هايي از ويتامين D₃ به عنوان عوامل شيمي درماني سرطان معرفي شده اند (داسو و همكاران^۱،۲۰۰۵ ;اوسبورن و هاچنسن^۲،۲۰۰۲). مطالعات نشان مي دهند كه ۱,۲۵(OH)₂D₃موجب مهار رشد سلولي و نيز القاء مرگ سلولي در سلول هاي سرطاني پستان هم در In vitro و هم در In vivo مي شود( والرانس و ولش^۳ ،۲۰۰۴).
VDR درغدد پستان طبيعي بيان مي شود، يعني جايي كه به عنوان عامل مهار تكثير و القاء كننده تمايز  سلولي عمل مي كند و اين نشان مي دهد كه ۱,۲۵(OH)₂D₃ در تنظيم مهار رشد سلول هاي اپي تليال پستان نقش دارد(ولش و همكاران^۴ ،۲۰۰۳).
ضمناً ميزان بيان ژن VDR يعني سطح mRNA اين ژن در سرطان پستان همانند سرطان هاي  كولون و ريه كاهش و در سرطان تخمدان شديداًً افزايش مي يابد ( اندرسون و همكاران^۵،۲۰۰۵). ژن VDR با طولي بالغ بر Kb 75 درمنطقه كروموزوم۱۴-۱۲q12 قرار داشته وداراي پلي مورفيسم هاي مختلفي است كه ارتباط برخي از آن ها با بعضي از بيماري ها بررسي شده است. پلي مورفيسم FokI  كه در سمت′ ۵  ژن VDR در اگزون ۲ قرار دارد ، موجب كوتاهتر شدن محصول پروتئيني اين ژن مي شود BsmI  و TaqI اثري بر محصول پروتئيني حاصل ندارند،زيرا جايگاه پلي مورفيك BsmI در  اينترون ۸ قرار دارد وجايگاه پلي مورفيك TaqI واقع در اگزون ۹ به گونه اي است كه هر دو الل آن همان اسيد آمينه يعني ايزولوسين را كد مي كنند. مكانيسمي كه از طريق آن اين پلي مورفيسم ها ممكن است بر روي  عملكردمحصول ژن VDR تاثير بگذارند، مشخص نيست، اما احتمالا ازطريق تاثير بر روي پايداري mRNA ، تنظيم فعاليت
نسخه برداري وكارايي ترجمه موجب تغيير عملكرد اين ژن مي شوند ( ماكيشيما و همكاران^۱،۲۰۰۲; گوي و همكاران^۲ ،۲۰۰۳; داردن و همكاران^۳،۲۰۰۳(.
تاكنون تحقيقات مختلفي در ارتباط با بررسي همبستگي بين پلي مورفيسم هاي مختلف ژن VDR با سرطان  پستان در برخي جمعيت هاي انساني انجام شده است.نتايج بدست آمده از اين تحقيقات بسته به نوع جمعيت مورد  مطالعه و نيز نوع جايگاه هاي پلي مورفيك بررسي شده متفاوت بوده، به طوري كه برخي به وجود همبستگي و بعضي ديگر به عدم وجود همبستگي اشاره كرده اند. بنابراين انجام تحقيقات در جمعيت هاي ديگر از جمله جمعيت كشورمان براي نتيجه گيري هر چه صحيح تر در مورد همبستگي بين جايگاه هاي پلي مورفيك  مختلف ژن VDR با سرطان پستان الزامي است.
هدف اصلي اين پژوهش تعيين همبستگي بين الل‌ها و ژنوتيپ ‌هاي پلي‌مورفيسم TaqI ژن VDR با سرطان پستان و بررسي اثر كاهش سطح ويتامينD بر روي بروز اين نوع سرطان مي باشد.
ضرورت انجام تحقيق:
در اين زمينه مطالعات و تحقيقات زيادي در نقاط مختلف دنيا و در ميان جمعيت‌هاي مختلف قومي و نژادي انجام گرفته است و نتايج حاصله ضد و نقيض بوده بطوريكه نتايج قطعي تاكنون به دست نيامده است. با توجه به اهميت موضوع و افزايش روز