دانشگاه آزاد اسلامي
واحد دامغان
دانشكده علوم پايه
پايان نامه براي دريافت درجه كارشناسي ارشد «M.Sc.»
گرايش ميكروبيولوژي
عنوان:
بررسي مقاومت نسبت به ناليديكسيك اسيد و مطالعه مولكولي آن در
سويه هاي شيگلا جدا شده از موارد باليني در تهران
استاد راهنما:
دكتررضا رنجبر
استاد مشاور:
دكتر مجيد مقبلي
تكه هايي از متن به عنوان نمونه :
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چكيده ۱
فصل اول:كلـيات تحقيق
۱- مقدمه ۲
۱-۱ بيان مسئله ۲
۱-۲ كليات ۴
۱-۲-۱ باكتريولوژي شيگلا. ۴
۱-۲-۲ طبقه بندي شيگلا. ۴
۱-۲-۳ فاكتورهاي ويرولانس شيگلا. ۵
۱-۲-۴ توصيف علائم بيماري ناشي از عفونت با شيگلا. ۶
۱-۲-۵ اپيدميولوژي. ۷
۱-۲-۶ تشخيص آزمايشگاهي. ۸
۱-۲-۶-۱ كشت ۸
۱-۲-۶-۲ تست هاي بيوشيميايي. ۹
۱-۲-۶-۳ روش هاي مولكولي(PCR ) 10
۱-۲-۷ كنترل و پيشگيري. ۱۰
۱-۲-۷-۱ بهداشت فردي. ۱۰
۱-۲-۷-۲ واكسن ها ۱۰
۱-۲-۸ درمان. ۱۱
۱-۲-۸-۱ مقاومت دارويي و اهميت آن در شيگلا. ۱۲
۱-۲-۸-۲ تاريخچه استفاده از كينولون ها و فلوروكينولون ها به عنوان آنتي بيوتيك ۱۳
۱-۲-۸-۳ كاربرد فلوروكينولون ها در درمان عفونت هاي انساني. ۱۴
۱-۲-۸-۴ مكانيسم عمل كينولون ها ۱۶
۱-۲-۸-۴-۱ آنزيم DNA جيراز ۱۶
۱-۲-۸-۴-۱-۱ نقش آنزيم DNA جيراز سلول هاي باكتريايي. ۱۷
۱-۲-۸-۵ مقاومت به فلوروكينولون ها ۱۷
۱-۲-۸-۵-۱ موتاسيون در ژن هاي شيگلا. ۱۸
۱-۲-۸-۵-۲ تغييرات در توپوايزومراز IV 18
۱-۲-۸-۵-۳ مقاومت وابسته به پلاسميد. ۱۹
۱-۲-۸-۵-۴ كاهش جذب و تغييرات در افلوكس پمپ ها ۲۰
۱-۲-۸-۵-۵ تغييرات در غشاء خارجي. ۲۰
۱-۲-۹ عوارض فلوروكينولون ها ۲۰
۱-۳ اهداف تحقيق. ۲۱
۱-۳-۱ هدف كلي تحقيق. ۲۱
۱-۳-۲ اهداف جزئي تحقيق. ۲۱
۱-۳-۳ هدف كاربردي. ۲۱
۱-۳-۴ فرضيات ۲۲
۳-۶ تعاريف واژه ها ۲۲
فصل دوم: مروري بر تحقيقات انجام شده
۲-۱ مروري بر تحقيقات انجام شده ۲۳
فصل سوم:مواد وروش ها
۳-۱- دستگاه‌ها، تجهيزات و مواد مورد استفاده ۲۶
۳- ۱- ۱- فهرست وسايل به كار گيري شده ۲۶
۳- ۱- ۲- فهرست مواد به كار گيري شده ۲۷
۳- ۱- ۳- تركيبات و محلول هاي مورد نياز و فرمول ساخت ۲۷
۳-۲- روش مطالعه و اجراي طرح. ۲۸
۳- ۲- ۱- نوع مطالعه ۲۸
۳- ۲- ۲- جامعه مورد مطالعه ۲۸
۳- ۲ – ۳- تعداد نمونه هاي مورد استفاده ۲۸
۳-۲–۴- روش تجزيه و تحليل داده ها ۲۸
۳- ۲- ۵- ملاحظات اخلاقي. ۲۹
۳- ۲- ۶- مشكلات و محدوديت ها ۲۹
۳- ۲ – ۷- جمع آوري اطلاعات بيماران. ۲۹
۳- ۳- انجام امور باكتريولوژيك ۲۹
۳- ۳ – ۱-كشت، جداسازي و تعيين هويت باكتريها ۲۹
۳- ۳ – ۲-بررسي حساسيت آنتي بيوتيكي. ۳۰
۳- ۳ – ۳- روش تعيين حساسيت باكتري ها نسبت به آنتي بيوتيك ۳۰
۳- ۳ -۳- ۱-تهيه ي محيط كشت ۳۰
۳- ۳ -۳- ۲-تهيه ي سوسپانسيون ميكروبي. ۳۰
۳- ۳ -۳- ۳-مرحله ديسك گذاري. ۳۱
۳- ۴- انجام آزمايشات مولكولي. ۳۱
۳- ۴ – ۱- استخراجDNA باكتري. ۳۱
۳- ۴ – ۱- ۱-كشت ۳۱
۳- ۴ – ۱- ۲- جداسازي رسوب باكتري. ۳۱
۳- ۴ – ۱- ۳- نگه داري DNA استخراج شده ۳۲
۳- ۴ – ۱- ۴- اندازه گيري مقدار DNA استخراج شده ۳۳
۳- ۴ – ۲- پرايمر هاي مورد استفاده جهت شناسايي ژنهاي gyrA. 33
۳ -۴-۲–۱- طراحي و سنتز پرايمر و بررسي كيفيت پرايمر ها ۳۳
۳-۴-۳- PCR 34
۳-۴-۳-۱-گراديانت دمايي جهت بدست آوردن دماي اتصال. ۳۴
۳-۴–۳-۱- بررسي جهش اي احتمالي بر روي ژن gyrA با استفاده ازPCR-RFLP پرايمر (L وD) 38
۳-۴–۴- الكتروفورز ۳۹
۳-۴-۴–۱- الكتروفورز محصول PCR 39
۳-۴-۴–۲- رنگ آميزي ژل و عكس برداري. ۳۹
۳-۴-۵- ترادف يابي. ۴۰
فصل چهارم:نتايج تحقيق
۴- ۱- نتايج كشت جداسازي و تعيين هويت باكتري ها و اطلاعات مربوط به بيماران. ۴۱
۴-۲- فراواني بيماران بر اساس سن و سال و جنس. ۴۲
۴-۳- نتايج مربوط به توزيع سرو گروه هاي شيگلا. ۴۳
۴-۴- نتايج مربوط به حساسيت آنتي بيوتيكي. ۴۴
۴-۵- نتايج آزمون PCR براي شناسايي ژنgyrA در سويه هاي مقاوم نسبت به ناليديكسيك اسيد. ۴۶
۴-۶- انجام آزمون روي ساير ايزوله ها توسط Primer L. 48
۴-۷- بررسي جهش هاي احتمالي بر روي ژن gyrA با بهره گرفتن از PCR-RFLP. 52
۴-۸- انجام آزمون روي ساير ايزوله ها توسط Primer D 57
۴-۹- بررسي جهش هاي احتمالي بر روي ژن gyrA با بهره گرفتن از PCR-RFLP. 61
۴ – ۱۰- نتايج مربوط به بررسي وجود ژنهاي qnrA، qnrB، qnrS در نمونه هاي باليني شيگلا. ۶۵
۴ – ۱۱- نتايج تعين توالي. ۶۸
فصل پنجم:بحث و نتيجه گيري
۵-۱ بحث و نتيجه‌گيري. ۷۴
منابع فارسي و لاتين. ۸۲
چكيده
شيگلوزيس بطور شايعي مربوط به كودكان بوده به طوري كه در اغلب موارد عفونت را كودكان كمتر از پانزده سال سن تشكيل مي دهند. فلوروكينولونها بطور موفقيّت آميزي براي درمان شيگلوزيس، از جمله عفونتهاي ناشي از سويههاي با مقاومت چند گانه آنتي بيوتيكي استفاده ميگردند. اما به مرور زمان سويه هاي مقاوم آنتي بيوتيكي به وجود آمده است، اهميّت اين موضوع به اين دليل است كه مصرف بي رويه و غير منطقي آنتي بيوتيك بدون توجه به الگو هاي مقاومتي مي تواند باعث ظهور سويه هايي شود كه حتي به درمان هاي جديد نيز مقاومت داشته باشند و ظهور سويه هاي جديد مقاوم به ناليديكسيك اسيد روشن كننده اين واقعيّت مي باشد. بنابراين بررسي مولكولي اين نوع مقاومت ها بسيار حائز اهميّت خواهد بود. گزارشات در خصوص بروز سويههاي شيگلا مقاوم به فلوروكينولون ها محدود است. لذا مطالعه حاضر با هدف بررسي فراواني موتاسيونهاي ژن gyrA ژنهاي و وجود qnr در سويههاي شيگلا هاي جدا شده از بيماران مبتلا به شيگلوز در تهران انجام گرديد. در مجموع ۷۳ سويه شيگلا جدا شده از موارد باليني در اين مطالعه مورد بررسي قرار گرفت. سويههاي شيگلا با بهره گرفتن از روشهاي استاندارد ميكروبيولوژيك جداسازي و تعيين هويت گرديدند. تست حساسيت آنتي بيوتيكي و غربالگري سويههاي شيگلا مقاوم به فلوروكينولونها مطابق با دستورالعملهاي استاندارد CLSI انجام پذيرفت. حضور ژنهاي qnr از جمله qnrA، qnrB و qnrS توسط تكنيك PCR با بهره گرفتن از پرايمرهاي اختصاصي مورد بررسي قرار گرفت. همچنين تكثير از لوكوس ژنتيكي ناحيه مقاومت كينولوني ژن gyrA با بهره گرفتن از PCR انجام پذيرفت. سپس موتاسيونهاي ژن gyrA توسط تكنيكRFLP و با بهره گرفتن از آنزيم محدود الاثر HinfI تعيين گرديد. تمام آمپليكونهاي مربوط به نمونههاي موتانت مشخص شده توسط هضم آنزيمي با ترادف يابي مورد تاييد قرار گرفت. نتايج مربوط به حساسيت آنتي بيوتيكي بر روي ۷۳ نمونه باليني شيگلا نشان داد كه ۲/۹۷ درصد از ايزوله ها حداقل به يكي از ۱۸ آنتي بيوتيك مقاومت نشان مي دهند و بيشترين ميزان مقاومت به آنتي بيوتيك ها به ترتيب تري متوپريم+سولفامتوكسازول (۵/ ۹۴ درصد) و بعد از آن استرپتومايسين (۲/۹۳ درصد) و تتراسايكلين (۲/۹۳ درصد) بود. همچنين هيچ ايزوله اي به آنتي بيوتيك سيپروفلوكسازين و سفتي زوكسيم مقاومت نشان نداد. ۲۳ (۶/۳۱ درصد) ايزوله مقاومت به ناليديكسيك اسيد را نشان دادند. همچنين تمامي نمونه هاي موتانت پس از PCR با بهره گرفتن از پرايمر DgyrA و سپس بدنبال انجام هضم آنزيمي الگوي باندي ۲۳۴و۲۷۷ جفت بازي را نشان داده و همين نمونه ها در مورد پرايمر LgyrA الگوي باندي۳۱۵ و۳۳۳ را به نمايش گذاشتند. نمونه هاي نرمال حاصل از تكثير پرايمر DgyrA نيز پس از انجام RFLP قطعات۹۹و۱۷۸و۲۳۴جفت بازي را نشان داده و همين نمونه ها در مورد پرايمر LgyrA قطعات۹۹و۲۳۴و۳۱۵ جفت باز را نمايش دادند. تمامي نتايج با Sequencing تاييد گرديد. در خوانش كامل اوليه از موتانت هاي واجد موتاسيون در ژن gyrA، تغير نقطه اي در كدون۸۳ نشان داده شد كه حاصل جايگزيني يك نوكلئوتيد به نوكلئوتيد ديگر بوده است. نتيجه اين تغير، جايگزيني اسيد آمينه سرين به لوسين بود. در خوانش كامل دومين موتانت هاي واجد موتاسيون در ژن gyrA، تغير نقطه اي در كدون۸۳ نشان داده شد كه حاصل جايگزيني يك نوكلئوتيد به نوكلئوتيد ديگر بوده است. از ميان دو نمونه موتانت شيگلا ۱ نمونه (۵۰درصد) به سروتايپ شيگلا فلكسنري و ۱ نمونه (۵۰درصد) به سروتايپ شيگلا سونئي تعلق داشت. از ميان ۲۳ سويه مقاوم شيگلا مقاوم به ناليديكسيك اسيد، ۴ نمونه واجد ژن qnrS بودند.
مطالعه حاضر، براي اولين بار به صورت جامع، مكانيسم مولكولي مقاومت به ناليديكسيك اسيد در سويههاي شيگلا در تهران را مشخص نمود.
واژههاي كليدي: موتاسيونهاي gyrA، ناليديكسيك اسيد، ژن qnr، شيگلا
۱- مقدمه
۱-۱ بيان مسئله
شيگلا يكي از اعضاي خانواده بزرگ باكتريهاي روده اي يعني انتروباكترياسه مي باشد. بيش از چهل سروتايپ مختلف از اين باكتري در چهار گونه يا سروگروه اصلي شامل: سروگروهA ( شيگلا ديسانتريه)، سروگروه B (شيگلا فلكسنري)، سروگروه C (شيگلا بوئيدي) و سروگروه D (شيگلا سونئي) شناسايي شده اند. بيماري شيگلوز (ديسانتري يا اسهال خوني باسيلي) يك گاستروانتريت ناشي از آلودگي با گونه هاي باكتريايي جنس شيگلا مي باشد ; ۲۰۰۳) Ranjbar et al). شيگلوز همراه با درد هاي شديد شكمي، درد، تب، مدفوع خوني و موكوسي شناخته مي شود. در ميان ۵۰ سروتايپ شيگلا ديسانتري تيپ ۱ به شدت بيماري زا مي باشد(et al; 2005 Niyogi).
ديسانتري باسيلي بطور شايعي مربوط به كودكان بوده به طوري كه هفتاد درصد از موارد عفونت را كودكان كمتر از پانزده سال سن تشكيل مي دهند. شيگلوز از طريق دهاني – مدفوعي انتقال مي يابد. اين بيماري در ابتدا از طريق دستان آلوده افراد و به ميزان كمتر از طريق آب يا غذاي آلوده منتقل مي شودRanjbar et al; 2008)).
سالانه ۵ ميليون مورد مرگ و مير ناشي از گاستروانتريت در كشورهاي در حال توسعه رخ مي دهد كه دست كم ده درصد اين موارد به دليل ديسانتري ناشي از شيگلا است (Koorosh et al; 2003). اغلب موارد شيگلوز در سنين پس از شير خوارگي به خصوص در سن نوپايي ديده مي شودMache et al; 1997)). اثر منفي عفونت شيگلايي بر رشد و نمو و سوء تغذيه كودكان در مطالعات مختلف نشان داده شده است. شيوع عفونت شيگلايي در ميان عوامل ايجادكننده گاستروانتريت هاي حاد بر اساس مطالعات انجام شده در تهران ۱ تا ۲ در صد مي باشد. به نظر مي رسد، تنوع فراواني الگو هاي ژنتيكي موجود در يك گونه شيگلا مانند: شيگلا سونئي در يك كشور باعث بروز الگوها ي متنوع مقاومت به آنتي بيوتيك شده است. الگوي متنوع مقاومت به آنتي بيوتيك در نقاط مختلف جغرافيايي همواره انتخاب يك داروي مناسب براي شيگلا را مشكل كرده است و به همين علّت، انجام مطالعات مقاومت دارويي ضروري است. با توجه به افزايش مقاومت به آنتي بيوتيك هاي مختلف در سال هاي اخير در نقاط مختلف دنيا، انتخاب بيماران كه كانديدهاي درمان آنتي بيوتيكي هستند از اهميّت بالايي برخورداراست (Peirano et al; 2006).
پاتولوژي پيچيده سندرم اسهال خوني بازتابي از وجود تركيبات متنوع ژنتيكي كنترل كننده بيماري زايي اين ارگانيسم است. مهمترين عامل بيماري زا در اين باكتري اگزو توكسين آن مي باشد، كه به دو زير واحد A وB با سميّت بسيار بالا تقسيم مي شود كه يك مولكول هگزامري با وزن مولكولي حدود ۷۰ كيلو دالتون است كه با اتصال به رسپتور هاي سطحي سلول هدف باعث اپوپتوزيس و مرگ سلول خواهد شد. اين توكسين را شيگلا ديسانتري نوع ۱ توليد مي كند و توكسيني مشابه آن را اشرشيا كولي توليد مي كند به نام هاي ۱stx و۲stx كه تا ۹۸ درصد تشابه دارند. حساسيت سلول هاي اندوتليال كليه انسان به stx در مقايسه با ۱stx تا ۱۰۰۰ برابر بيشتر است به همين دليل عامل اصلي بيماري خون ادراري HUS معرفي گرديده است. سميّت و قدرت ايمني زايي شيگا توكسين stx بسيار بالا مي باشد به شكلي كه حدود ۲۸ نانو گرم از آن باعث مرگ يك موش مي شود و همچنين به دليل داشتن قدرت آنتي ژني بالا داراي پتانسيل ايجاد پاسخ ايمني و توليد آنتي بادي عليه توكسين در بدن بيمار مي شود. زير واحد stxBبا ۶۹ اسيد آمينه و زير واحد stxAبا حدود ۲۹۴ اسيد آمينه با وزن مولكولي در حدود ۳۲ كيلو دالتون متصل است. رسپتور زير واحد B به رسپتور سطحيGb3 متصل شده و تشكيل يك كمپلكس را مي دهد (Goguen et al; 2003).
افزايش مقاومت نسبت به اكثر آنتي بيوتيك هاي رايج به يك نگراني بزرگ در كشورهاي توسعه يافته و در حال توسعه تبديل شده است. كينولون ها ازجمله ناليديكسيك اسيد به عنوان داروي خط اول در درمان عفونت هاي ناشي از شيگلا مورد استفاده قرار مي گيرد، اما متأسفانه در برخي از مطالعات مقاومت به اين آنتي بيوتيك گزارش شده است. براي مثال در ايران نتايج مطالعات نشان داده است در سال هاي ۲۰۰۱ تا ۲۰۰۳ ، ميزان مقاومت به اين آنتي بيوتيك ۱۳ درصد بوده و اين ميزان در سال هاي ۲۰۰۴ تا ۲۰۰۶ به ۲۵ درصد افزايش يافته است. ناليديكسيك اسيد به دليل مقرون به صرفه بودن از مناسب ترين آنتي بيوتيك ها به شمار مي آيد. كينولون ها و فلوروكينولون ها تركيباتي هستند كه هدف آنها DNA جيراز و توپوايزومراز IV مي باشد و با ايجاد كمپلكس دارو سبب جلوگيري از سنتز اسيد نوكلئيك مي شوند. با توجه به افزايش مقاومت و انجام نگرفتن مطالعات جامع مولكولي بر روي سويه هاي مقاوم نسبت به ناليديكسيك اسيد، بر آن شديم به مطالعه شيوع موتاسيون ها بر روي ژنgyrA و بررسي وجود ژنهاي qnr در سويه هاي سويه هاي مقاوم نسبت به ناليديكسيك اسيد شيگلا جدا شده در تهران بپردازيم.
۱-۲ كليات
۱-۲-۱ باكتريولوژي شيگلا
شيگلا متعلق به خانواده انتروباكترياسه مي باشد. اين باكتري غير متحرك و بدون كپسول مي باشد. ۴ گونه شيگلا وجود دارد كه بر اساس خصوصيات بيوشيميايي مختلف طبقه بندي مي شوند. زير
