وان:

تعيين ترادف اپرون ار. ان. اي ريبوزومي و آناليز فيلوژنتيكي فيتوپلاسماهاي همراه با بيماري تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر

استاد راهنما:

دكتر محمد صالحي

استاد مشاور:

دكتر ساغر كتابچي

تكه هايي از متن به عنوان نمونه :
چكيده
پيشتر بيماري تورم جوانه بادنجان و گوجه فرنگي به عنوان يك بيماري شايع و خسارتزا از استان بوشهر گزارش شده است. تحقيق مذكور بوته هاي آلوده بادنجان و توتون استان بوشهر متعلق به مناطق بنداروز، برازجان، بوشهر و كنگان را پس از انتقال به آزمايشگاه مركز تحقيقات كشاورزي و منبع طبيعي فارس-زرقان مورد بررسي و مطالعه قرار داده و ذكر نموده است كه جدايه هاي مورد مطالعه بر اساس علائم ايجاد شده در گياه پروانش به سه گروه تقسيم مي شوند. RFLP ژن ريبوزومي ۱۶S نيز نتايج داده هاي بيولوژيك را تاييد كرده است. پيرو تحقيق مذكور، در اين تحقيق تعداد شش جدايه شامل پنج جدايه از بادنجان و يك جدايه توتون موجود بر روي گياه پروانش انتخاب و دي.ان.اي استخراج شده از بافت­هاي گياهي (نمونه هاي برگ پروانش) طبق روش پيشنهادي مايكسنر و همكاران (۱۹۹۵) در آزمايش هاي بعدي مورد استفاده قرار گرفتند. در آزمون PCR با بكارگيري جفت آغازگر P1/P7 ناحيه اپرون ار. ان. اي ريبوزومي جدايه هاي مذكور تكثير گرديد. هضم محصول PCR با آنزيم هاي Rsa I و Hinf I جدايه هاي مورد مورد تحقيق را به ۳ گرو تقسيم كرد (جداي هاي ۱،۴ و ۵ در يك گروه، جدايه ۲ در يك گروه و جدايه ۳ و ۶ در گروه ديگر)، آنزيم Hae III جدايه ها را به دو گروه تقسيم كرد (۱، ۲، ۴ و ۵ در يك گروه و جدايه هاي ۳ و۶ در گروه ديگر) ولي آنزيم Alu I نتوانست مابين جدايه ها تمايز حاصل كند. قطعه­هاي تكثير شده در آزمون PCR با استفاده ازIns T/A clone PCR Product Cloning Kit (MBI Fermentas) در پلاسميد PTZ57R/T وارد و در سويه DH5α باكتري Escherichia coli همسانه سازي گرديد. آناليز ترادف نوكلئوتيدي نتايج آزمون RFLP را تاييد و جدايه ها را در سه گروه قرار داد. لازم به ذكر است آناليز فيلوژنتيك ناحيه اپرون ريبوزومي گروه يك را به دو زير گروه تقسيم كرد بطوري كه جدايه ۱، ۴ را در يك زير گروه و جدايه ۵ در زيرگروه ديگر قرار گرفت. علاوه بر اين جدايه هاي گروه ۲ (جدايه هاي ۳ و ۶) نيز هر كدام در يك زير گروه قرار گرفتند. البته جدايه ۳ با داشتن يك جايگاه برشي اضاف تر در موقعيت ۹۳۸ با آنزيم برشي Hpa II مي تواند از جدايه ۶ متمايز گردد.
۱-۱- مقدمه
براساس خوش­بينانه ترين برآوردها، جمعيت جهان در پايان نيمه اول قرن بيست و يكم از مرز ده ميليارد نفر خواهد گذشت. اين در حالي است كه بانك جهاني در سال ۱۹۹۴ اعلام كرده حدود هشتاد و سه درصد از اين جمعيت مربوط به كشور هاي در حال توسعه مي باشد. بدون شك مهمترين و حياتي ترين نياز اين جمعيت عظيم غذا و امنيت غذايي مي­باشد. مطمئنا از طريق افزايش بهره وري، استفاده مناسب از وسايل و منبع توليد از جمله آب، خاك، نيروي انساني آموزش ديده و. مي­توان به توليد پايدار دست يافت و در نهايت بخشي از امنيت غذايي تامين كرد. در اين مبحث حفاظت از گياهان، كنترل آفات، بيماريها و      علف هاي هرز حائز اهميت فوق العاده مي­باشد. بعنوان مثال برابر تخمين وزارت كشاورزي آمريكا بيماريهاي گياهي سالانه ۹.۱، آفات ۷.۷ و علف هاي هرز ۶.۲ ميليارد دلار فقط در ايالات متحده خسارت وارد مي­ كنند. خسارت گياهي ناشي از آفات و بيماري ها نه تنها در عرضه مواد غذايي در سطح ملي و بين المللي تاثير دارد بلكه بر زندگي زارعي كه گياه را براي مصرف مستقيم خود يا حتي براي فروش كاشته است نيز تاثير خواهد گذاشت.
رده ماليكيوت­ها گروهي از پروكاريوت­هاي فاقد ديواره سلولي بوده كه از نظر تكاملي از باكتري­هاي گرم مثبتي كه درصد مجموع سيتوزين و گوانين پايين دارند مشتق شده اند. بعضا اين گروه توانايي بيماريزايي در گياهان را دارند. از بيمارگرهاي گياهي واقع در اين گروه مي توان به اسپيروپلاسماها (داراي سلول هاي مارپيچ، متحرك و قابل كشت) و فيتوپلاسماها (سلول هاي غير مارپيچ و غير قابل كشت) اشاره كرد (Weisburg et al. 1989). از زمان كشف فيتوپلاسماها در سال ۱۹۶۷ ميلادي تا كنون بيش از صد ها بيماري همراه با فيتوپلاسما در بيش از ۳۰۰ جنس گياهي شناخته شده است (Lee et al., 2000, McCoy et al., 1979 and Seemuller et al., 1998).
فيتوپلاسماها با نام قبلي شبه مايكوپلاسما(MLO) (IRPCM, 2004) محدود به آوند هاي آبكشي گياهان ميزبان و همچنين همولنف حشره ناقل مي­باشند (Lee et al., 2000). اين گروه از بيمارگرهاي گياهي در طبيعت توسط ناقلين مكنده كه عمدتا زنجرك­هاي برگي(Leafhopper) بوده و متعلق به خانواده Cicadellidae مي­باشند (Lee et al., 2000) با روش پايا و تكثيري (Firrao et al., 2005) گسترش پيدا مي­ كنند. البته در مواردي پسيل ها نيز بعنوان ناقل اينها گزارش شده اند (Lee et al., 2000). بيماري هاي فيتوپلاسمايي اغلب باعث عقيمي و مرگ گياه ميزبان شده و معمولا داراي خسارتي كم و بيش معادل صد در صد مي باشند كه اين خسارت شامل كاهش كيفيت و كميت محصول مي­باشد.
در ايران تاكنون پيرامون بيماري هاي فيتوپلاسمايي تحقيقات گستردهاي انجام شده است (صالحي و همكاران ۱۳۸۵). يكي از بيماري هاي مهم فيتوپلاسمايي در ايران بيماري تورم جوانه در بادنجان، گوجه فرنگي و توتون مي باشد (صالحي و ايزدپناه ۱۳۷۷، صالحي و همكاران ۱۳۷۹ و رئوفي و همكاران ۱۳۸۹). علائم در اين بيماري شامل: گل سبزي، برگ ساني، تورم جوانه، عقيم شدن، كاهش تعداد و اندازه گل، ازدياد جوانه هاي جانبي ساقه، جاروئي شدن انتهاي ساقه، طويل شدن غير معمول ميانگره، ريز برگي، تغيير رنگ برگها و جوانه ها، پيچيدگي و قاشقي شده برگها، سرخشكيدگي، زوال و مرگ گياه مي­باشد (Lee et al., 2000).
حدود ۴۸۳ هزار هكتار از اراضي كشور سالانه (سال زراعي ۸۵-۱۳۸۴) به گروه سبزي جات اختصاص داشته است. حدود نيمي از اين مقدار در ۷ استان خوزستان، فارس، كرمان، اصفهان، هرمزگان، آذربايجان شرقي و همدان كشت شده است. استان بوشهر در اين سال با كشت حدود ۷۵/۳ درصد سبزيجات مقام ۱۳ را به خود اختصاص داده است. از ۱۷ هزار هكتار سطح زير كشت در اين استان حدود ۱۴ هزار هكتار به محصول گوجه فرنگي و حدود ۲ هزار هكتار به ساير سبزي جات از جمله بادنجان، فلفل و. اختصاص داشته است. علاوه بر موارد ذكر شده، استان بوشهر مقام اول توليد گوجه فرنگي خارج از فصل را در كشور به خود اختصاص داده است (آمارنامه كشاورزي ۱۳۸۴).
بيماري تورم جوانه در گياهان بادنجان، گوجه فرنگي و توتون يكي از مهمترين بيماري هاي
سيفي جات مي باشد (Shew and lucas1991). بيماري تورم جوانه پيشتر از مزارع ورامين-اطراف كرج (اسكندري و همكاران ۱۳۴۹) فارس (صالحي و همكاران ۱۳۷۴) استانهاي اردبيل اصفهان و آذربايجان غربي (رشيدي و همكاران ۱۳۸۵) و خراسان (جمشيدي و همكاران ۱۳۸۹) گزارش شده است. اين بيماري داراي خسارات عمده و چشمگيري در استان بوشهر و به ويژه مناطق برازجان، كنگان و بنداروز مي­باشد (رئوفي و همكاران ۱۳۸۹). بررسيهاي سالهاي ۱۳۸۷ و۱۳۸۸ نشان داد كه اين بيماري در اكثر مزارع بادنجان استان بوشهر وجود دارد. با توجه به علائم ناشي از مايه زني عامل بيماري تورم جوانه بادنجان به گياه پروانش و مقايسه چند شكل طولي قطعات برشي محصول واكنش زنجيره اي پليمراز (PCR-RFLP) نشان داد كه فيتوپلاسماهاي عامل تورم جوانه بادنجان در استان بوشهر متنوع است و حداقل به سه گروه تقسيم مي­شوند. (رئوفي و همكاران ۱۳۸۹).
با توجه به اهميت بيماري و اينكه ماهيت فيتوپلاسمايي عامل بيماري به ويژه از نظر گروهبندي و شباهت و يا تفاوت با فبتوپلاسماهاي ديگر در ايران و دنيا مشخص نشده بود، در تحقيق حاضر مطالعات زير انجام گرديد.
۱- انتقال همزمان عامل جدايه هاي مختلف بيماري تورم جوانه به پروانش هاي همسن و مقايسه علائم بيماري در آنها
۲- تكثير يك قطعه ۱۸۰۰ جفت بازي از اپرون ار. ان. اي ريبوزومي در آزمون PCR با جفت آغازگر P1/P7
3- RFLP فيزيكي محصول PCR با آنزيم هاي Alu I، Hinf I، Hae III و Rsa I
4- همسانه سازي و تعيين ترادف محصول PCR
5- انجام آناليز هاي مختلف مولكولي شامل جستجو با برنامه بلاست، بررسي ميزان همولوژي، ترسيم درخت فيلوژنتيكي، RFLP كامپيوتري و در نهايت تعيين موقعيت فيتوپلاسما (فبتوپلاسماهاي) عامل تورم جوانه در بين فيتوپلاسماها از نظر گروه هاي اصلي و زيرگروه ها
-۱-بادنجان
۲-۱-۱-تاريخچه بادنجان
اين گياه بومي آسيا بوده و احتمالا در مناطقي از هندوستان و يا چين كشت مي­شده است. در هندوستان كشت اين گياه داراي قدمت تاريخي بالايي مي­باشد. و طبق مدارك موجود در قرن پنجم كشت اين گياه در چين مرسوم بوده ولي اروپا قدمت چنداني در كشت اين محصول ندارد (Singh et al., 1997 and Splittstosser 1990). به­نظر مي رسد كه مسلمانان در گسترش اين گياه به اروپا نقش عمده و موثري داشته اند (مبلي و پيراسته ۱۳۷۳).
۲-۱-۲- مشخصات گياه شناسي
گياهي يك­ساله متعلق به نهاندانگان دولپه بوده ولي بسته به شرايط آب و هوايي مي تواند بيش از يك سال نيز دوام بياورد (Halfaere and Barden 1979). اين گياه متعلق به تيرهSolanaceae و با نام علمي Solanum melogenaمي باشد. ساقه اين گياه قوي، خشن و چوبي بوده و ارتفاع آن مي ­تواند به ۶۰ سانتي متر تا يك متر برسد. برگ هاي پهن و كشيده آن بصورت متناوب روي ساقه قرار مي­گيرد و ممكن است با كرك پوشيده شده باشد. ميوه اين گياه قلمي يا كشيده با رنگهاي ارغواني، سياه، بنفش، بنفش مايل به سياه و يا سفيد است. بهترين دما جهت رشد بادنجان ۳۲-۲۶ درجه سانتي گراد در روز و ۲۶-۲۱ درجه در شب مي باشد (Halfare and Baren 1979). اين گياه نسبت به گوجه فرنگي حساسيت بيشتري به سرما دارد (Ware and McCollum 1980).
2-1-3-ارقام بادنجان:
۲-۱-۳-۱- بادنجان پاكوتاه (Dwarf eggplant):
نام علمي اين واريته Solanum melonena Var. depressumمي­باشد. ميوه بسيار كوچك، بنفش رنگ و گلابي شكل است. طول دوره رشد كوتاه مي باشد (شيباني ۱۳۶۷).
۲-۱-۳-۲-بادنجان قلمي (Snake eggplant):
نام علمي اين واريته Solanum melogena Var. serpentinum مي­باشد. ميوه در اين نوع بسيار دراز و باريك به طول ۳۰-۲۵ سانتي متر و قطري در حدود ۴-۳ سانتي متر مي­باشد (شيباني ۱۳۶۷).
۲-۱-۳-۳-بادنجان معمولي (Common eggplant):
نام علمي اين واريته Solanum melogena Var. esculentumمي­باشد. ارتفاع بوته در اين بادنجان تا ۱۲۰ سانتي متر نيز مي­رسد. طول ميوه ۴-۳ برابر قطر آن مي­باشد (شيباني ۱۳۶۷).
۲-۲-گوجه فرنگي
۲-۲-۱-تاريخچه
يكي از مهمترين سبزي­هاي دنياست. ممكن است بومي آمريكاي مركزي باشد (Halfaere and Barden 1979) ولي برخي منابع موطن آنرا آمريكاي جنوبي مي دانند (قادري ۱۳۵۳، Halfare and Barden 1979). نام گوجه فرنگي (Tomato) گرفته شده از يك كلمه مكزيكي بنام Tomati مي­باشد (Rodale et al., 1977). در ابتدا گوجه فرنگي را يك گياه زينتي محسوب مي­كردند (Nonnecke 1989) و ميوه آنرا سمي مي­دانستند (Everett 1984). در سال ۱۹۵۶ اين گياه به اروپا انتقال داده شده است (Everett 1984).
2-2-2-مشخصات گياه شناسي
نام علمي اين گياه Lycopersicum esculentum بوده و به تيره Solanaceae تعلق دارد. اين گياه مي تواند در مناطق سردسير بصورت گياهي يك ساله و يا در مناطق گرمسير بصورت گياهي چند ساله مطرح باشد (Janick 1989 and Gollan 1992). برگها مركب و ساقه جوان آن پوشيده از كرك هاي ريز و سفيد مي­باشد. ساقه در هنگام جواني گياه سبز، كرك دار، گرد و خيلي شكننده است. برگ هاي مركب بصورت متناوب روي ساقه قرار دارند. گل در اين گياه كامل (Perfect flower) و هر خوشه بين ۸-۴ گل دارد (Halfaere and Barden 1979). اين گياه به طول دوره روشنايي در روز حساس نبوده ( Nonnecke 1989) ولي چنانچه ميزان روشنايي كمتر از ۵ ساعت باشد يا اينكه در معرض روشنايي دائم باشد ميوه نمي­دهد (Splittstoesser 1990). بهترين دما جهت رشد ونمو اين گياه ۲۹-۱۹ درجه
سانتي­گراد مي­باشد (Ware and Mccollun 1959) و در دماي بالاي ۳۵ درجه رشدش متوقف و ميوه تشكيل نمي­ شود (Ware and Mccollum 1980) در دماي پايين تر از ۱۵ درجه امكان تلقيح براي گلها وجود ندارد (Nonnecke 1989).
2-2-3-ارقام گوجه فرنگي