رشته :
بيماري شناسي گياهي
مقطع :
كارشناسي ارشد
استاد راهنما:
جناب آقاي دكتر محمد علي تاجيك قنبري
استاد مشاور:
جناب آقاي دكتر مهدي پيرنيا
تكه هايي از متن به عنوان نمونه :
چكيده:
گونه هاي قارچ پني سيليوم به واسطه توليد آنتي بيوتيك پني سيلين، مايكوتوكسين و آنزيم به ويژه پكتيناز و اسيد فوليك در مصارف بيوتكنولوژيك متعدد مانند پزشكي، كشاورزي و صنايع غذايي و موارد ديگر كاربردهاي گوناگوني دارد.
آنتي بيوتيك پني سيلين تا كنون جان ميليون ها انسان را نجات داد. قارچ پني سيليوم با تعداد قريب ۲۰۰ گونه يكي از بزرگترين قارچ هاي خاكزاد و هوازاد است.
در اين تحقيق استخراج قارچ ها از خاك هاي مورد مطالعه از روش سوسپانسيون انجام شد. ۱ ميلي ليتر از سوسپانسيون نهايي به پتري هاي حاوي آگار، رزبنگال و استرپتومايسين اضافه گرديد. پس از ۷-۵ روز كلني هاي پني سيليوم شناسايي و به لوله هاي حاوي PDA منتقل گرديد.
جدايه هاي باكتري ها روي محيط NA تهيه مايه تلقيح آنها با جدايه هاي پني سيليوم تلقيح شدند. شفافيت و كدورت نمونه ها با نمونه شاهد مورد مقايسه قرار گرفت.
يك قرص از توده ميسليومي از محيط كشت شفاف انتخاب و به محيط PDB جهت تهيه توده ميسليومي منتقل گرديد. توده ميسليومي در هاون حاوي ازت پودر گرديد، پودرها حاوي ويال‌هاي ۵/۱ ميلي ليتري گرديد ۶۰۰ ميكرو ليتر بافر CTAB و ۱ ميكروليتر مركاپتانول اضافه گرديد. ويال ها وارد بن ماري شدند. با افزودن كلروفرم – ايزو آميل الكل سانتريفوژ انجام شده رسوب DNA با اتانول ۷۰ ٪ شستشو داده بافر TE اضافه شد.
تعيين غلظت و خلوص نسبي به دو روش ژل آگارز ۸/۰٪ و نيز با بهره گرفتن از دستگاه اسپكتروفتومتر انجام شد. DNA بدست آمده پس از ارزيابي جهت تكثير نواحي ريبوزومي مورد استفاه قرار گرفت. محصول PCR جدايه ها، جهت تعيين توالي به شركت BIONEER كره ارسال گرديد.
شناسايي مولكولي جدايه ها در پايگاه اطلاعات NCBI با بهره گرفتن از Blast انجام وبر اساس توالي هاي معتبر موجود در بانك بر اساس بالاترين ميزان شباهت به دست آمده است.
در بررسي مولكولي بيش از ۵۰ جدايه از ۸۰ جدايه، منجر به شناسايي گونه هاي ذيل گرديد.
Penicillium aculeatum, P.aurantiogriseum, P.chrysogenum, P.citrinum,
P.commune, P.crustosum, P.griseofulvum, P.pinophilum, P.simplicissimum
در بررسي هاي قابليت هاي آنتي باكتريال جدايه ها، كليه جدايه ها در تقابل با شش گونه باكتري بيماري زاي گياهي به طور همزمان كشت داده شدند و بر اساس نتايج به دست آمده غالب جدايه ها فعاليت ضد باكتريايي داشته و از رشد باكتري ها ممانعت كردند.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
فصل اول
مقدمه ۶
فصل دوم: بررسي منابع
۲-۱-محيط خاك . ۹
۲-۲-بيواكولوژي Bioecology 9
2-3-بخش زنده خاك ۹
۲-۴-رده بندي وال ورك (Wallwork) 12
2-5-ماكروارگانيسم هاي خاك ۱۲
۲-۶- ميكروارگانيسم هاي خاك ۱۳
۲-۷- شاخه نماتدها ۱۴
۲-۸- فلور ميكروبي خاك ۱۵
۲-۹- اكتينوميست هاي مهم و فراوان در خاك . ۱۸
۲-۱۰- جلبك ها (Algae) . 18
2-11- تعامل ميكروارگانيسم هاي خاك با يكديگر . ۱۹
۲-۱۲- كنترل بيولوژيك ۲۱
۲-۱۳- باكتري ها و خاك . ۲۵
۲-۱۴- ارزيابي فعاليت آنتي باكتريال پني سيليوم ها . ۲۶
۲-۱۵- پني سيليوم ها . ۲۸
۲-۱۶- فعاليت هاي بيولوژيك پني سيليوم ها ۲۹
۲-۱۷- تنوع ژنتيكي . ۳۱
۲-۱۸- مطالعات مولكولي قارچها . ۳۴
فصل سوم: مواد و روش ها
۳-۱-استخراج قارچ هاي خاك ۴۱
۳-۲-جدايه هاي باكتريايي ۴۲
۳-۳-ارزيابي توليد مواد بازدارنده رشد باكتريها . ۴۲
۳-۴- استخراج DNA 42
نتايج . ۴۸
نتايج شناسايي گونه ها . ۵۹
بحث . ۶۸
Abstract 78
منابع و مآخذ . ۷۹
مقدمه
مطالعات بيولوژي خاك شامل باكتري ها، جانوران، آغازيان و قارچ ها خاك است. از آنجا كه بررسي‌هاي مربوط به فعاليت هاي بيولوژيك خاك ها و به ويژه خاك هاي زراعي با شناسائي موجودات هر يك از زير مجموعه هاي زنده خاك شروع مي شود، تحقيقات مربوط به قارچ هاي خاك نيز نيازمند شناسائي فلور آنها است. جنبه هاي مختلف فعاليت قارچ هاي خاك در حاصلخيزي خاك هاي زراعي تأثير مستقيم و غير مستقيم داشته و غالب آنها در شرايط آزمايشگاهي قابل پيگيري مي‌باشند. از موارد قابل مطالعه در محيط آزمايشگاهي به توانائي جنس ها و گونه هاي مختلف ميكروميست ها در تجزيه مواد آلي به ويژه سلولز و قابل استفاده ساختن عناصر غذائي ماكرو ميكرو و آزادسازي آنها از منابع نامحلول موجود در خاك براي گياه مي توان اشاره كرد. از قارچ ها مي توان جهت بهبود شرايط باروري خاك ها و رشد و نمو مناسب تر گياهان در خاك هاي نامناسب و كم بازده كمك گرفت. بخشي از فلور قارچي خاك به عوامل بيماريزاي پارازيت اختياري و پارازيت اجباري تعلق دارد.
قارچ ها يكي از اجزاء زنده محيط خاك هستند. هر ساله مقادير متنابهي از بقاياي گياهان زراعي به خاك هاي مزارع اضافه مي شوند كه در نتيجه دخالت ميكروارگانيسم هاي خاكزي به ويژه قارچ ها تجزيه شده و مواد آلي حاصل از آنها به خاك افزوده مي گردد.
قارچ هاي خاك به گروه هاي تاكسونوميكي متفاوتي تعلق دارند كه فراوانترين آنها اووميكوتا، زيگوميكوتا دوتروميكوتا را مي توان نام برد. مطالعات مربوط به بيولوژي خاك در بخش قارچ ها با شناسائي تاكسونوميك آغاز و امكان پذير مي گردد.
سابقه شناسايي تاكسونوميك قارچهابه زمان آغاز نامگذاري دو اسمي موجودات زنده از زمان لينه برميگردد. از آن زمان تا به حال مطالعه مرفولوژيك قارچها تكامل زيادي يافته و با تكنيكهاي نوين به ويژه روش هاي مولكولي تلفيق گرديده است . تاجايي كه امروزه با معرفي و تكميل شناساگر هاي مولكولي و تعيين توالي قطعات مختلف ژنومي در حال تحول اساسي و كنار گذاشتن روش هاي مرفولوژيك است .
در اين تحقيق سعي شده تا يكي از فراوانترين قارچهاي خاكزاد مورد بررسي تاكسونوميك مولكولي قرارگرفته و از مجموع فعاليتهاي بي شمار آن ها در محيط خاك ، در شرايط آزمايشگاهي يكي از مهمترين آنها مورد مطالعه قرارگيرد.
۲-۱ محيط خاك
خاك از مواد معدني، ريشه گياهان، موجودات زنده خرد و درشت، مواد آلي در مراحل مختلف تجزيه، آب و هوا تشكيل شده است.
پراكنش غير يكنواخت اين اجزا، شرايط بسيار متنوعي را در مقياس هاي مختلفي از حفره هاي كوچك تا سطح مزرعه ايجاد، و اين امر، مطالعه خاك را با مشكل رو به رو مي كند. طيف وسيعي از عوامل فيزيكي و شيميايي كه داراي اثر متقابل هستند در تنوع خاك سهيم اند.
۲-۲ بيواكولوژي Bioecology
مطالعه و شناخت موجودات و همچنين رابطه اي كه بين آن ها و محيط اطرافشان وجود دارد مي‌باشد. در اين علم مطالعه موجودات و ارتباط آن با محيطي كه در آن بسر مي برند قرار مي گيرد.
۱-۲-۲ بيو اكولوژي خاك
مطالعه موجودات زنده خاك، همچنين شرايط محيطي كه اين موجودات در آن زندگي مي‌كنند و تعاملي كه بين اين موجودات و شرايط محيطي موجود در زيستگاه آنها حاكم است مورد بررسي قرار مي گيرد.
۲-۳ بخش زنده خاك
موجودات زنده خاك به دو گروه تقسيم مي شوند
-۳-۱ فلور كه در لاتين (flora) ناميده مي شود شامل قارچ ها، باكتريها ، اكتينوميست ها ، جلبك ها ، ويروس ها ، و گياهان مي باشند.
۲-۳-۲ فون كه در لاتين به نام (Fauna) ناميده مي شود كه به سه گروه بنام هاي ماكروفون، مزوفون و ميكروفون تقسيم شده است كه شامل جانوران مي باشد.
۲-۳-۳ بر اساس درشتي و ابعاد، موجودات زنده را به دو گروه ماكرو ارگانيسم و ميكروارگانيسم و ميكروارگانيسم ها را به ۵ سلسله از لحاظ رده بندي يا تاكسونومي بنام هاي مونرا (Monera) يا پروكاريوت ها، پروتيست ها (Protista) يا موجودات تك سلولي (آغازيان)، حيوانات (Animalia)، قارچ ها (Fungi) و گياهان (Planta ) تقسيم كرده اند.
هر تغييري كه در اكوسيستم خاك حادث شود ممكن است جمعيت موجودات زنده خاك اعم از فون و فلور را تحت تاثير قرار دهد و نيز موجودات زنده خاك موجب تغييرات فيزيكي و شيميايي خاك مي شود و به همين دليل در دراز مدت خواص شيميايي و فيزيكي خاك تحت تاثير موجودات زنده داخل خاك تغيير مي كند. اين تغيير در روي موجودات زنده داخل خاك اثر گذاشته و جمعيت آنها به تعادل ديناميك مي رسند.
۲-۳-۴ انواع موجودات زنده خاك بر اساس اندازه
۲-۳-۴-۵ ماكرو ارگانيسم ها (Macro-organisms) با چشم غير مسلح قابل مشاهده هستند.
۲-۳-۴-۶ ميكروارگانيسم ها (Micro-organisms) با چشم ميكروسكوپ قابل مشاهده هستند.
۲-۳-۴-۶ افراد هر يك از دو گروه، بر حسب منشاء گياهي يا حيواني كه دارند به دو دسته متمايز تفكيك مي شوند.
۲-۳-۴-۷ جانوران يا فون (Fauna)
