استاد راهنما:
نازيلا ارباب سليماني
استاد مشاور:
الهه تاج بخش
تكه هايي از متن به عنوان نمونه :
| فهرست مطالب | ||
| عنوان | صفحه | |
| چكيده | ۱ | |
| فصل اول: كليات تحقيق | ||
| مقدمه | ۲ | |
| فصل دوم: مروري بر تحقيقات گذشته | ||
| ٢ـ١ـ اشريشيا كلي يوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC) | ۴ | |
| ٢ـ٢ـ فاكتور هاي بيماري زاي توليد شده توسط UPEC | ۵ | |
| ٢ـ٢ـ١ـ ادهسين ها و فاكتور هاي موثر در كلونيزاسيون | ۵ | |
| ١_٢_٢_١_ پيلي يا فيمبريه (Fimbriae) | ۵ | |
| ٢_٢_٢_١_ فيمبريه نوع | ۶ | |
| ٣_٢_٢_١_ فيمبريه P | ۷ | |
| ۴_٢_٢_١_ فيمبريه S | ۸ | |
| ۵_٢_٢_١_ تاژك و تحرك | ۹ | |
| ۶_٢_٢_١_ Curli | ۱۰ | |
| ٧_٢_٢_١_ پيلي F جنسي | ۱۱ | |
| ٢ـ٢ـ٢ـ توكسين ها | ۱۱ | |
| ١_٢_٢_٢_ آلفا هموليزين | ۱۲ | |
| ٢_٢_٢_٢_ فاكتور نكروز دهنده سيتوتوكسيك (CNF_1) | ۱۲ | |
| ٢ـ٢ـ٣ـ بقاء و فرار از سيستم ايمني | ۱۲ | |
| ١_٢_٢_٣_ سيدروفور ها (آئروباكتين) | ۱۲ | |
| ٢_٢_٢_٣_ كپسول پلي ساكاريدي | ۱۳ | |
| ٣_٢_٢_٣_ تشكيل بيوفيلم | ۱۴ | |
| ٢ـ٣ـ عفونت هاي مجاري ادراري( Urinary Tract Infection; UTI) | ۱۴ | |
| ٢ـ٣ـ١ـ نقش پيلي در عفونت هاي مجاري ادراري | ۱۶ | |
| ٢ـ۴ـ بيوفيلم ها | ۱۷ | |
| ٢ـ۴ـ١ـ توسعه بيوفيلم | ۱۸ | |
| ٢ـ۴ـ٢ـ مقاومت آنتي بيوتيكي در بيوفيلم ها | ۲۰ | |
| ٢ـ۴ـ٣ـ بررسي ارتباط بين تشكيل بيوفيلم، فاكتورهاي يوروويرولان و مقاومت ضد ميكروبي | ۲۲ | |
| ٢ـ۵ـ نقش آب گريزي (Hydrophobicity) در اتصال باكتري اشريشيا كلي يوروپاتوژن | ۲۳ | |
| فصل سوم : مواد و روش ها | ||
| ٣ـ١ـ مواد و وسايل | ۲۴ | |
| ٣ـ١ـ١ـ محيط هاي كشت استفاده شده | ۲۴ | |
| ٣ـ١ـ٢ـ مواد شيميايي | ۲۴ | |
| ٣ـ١ـ٣ـ كيت ها | ۲۴ | |
| ٣ـ١ـ۴ـ دستگاه ها | ۲۴ | |
| ٣ـ٢ـ جمع آوري نمونه ها | ۲۵ | |
| ٣ـ٣ـ جداسازي و خالص سازي | ۲۵ | |
| ٣ـ۴ـ مشاهده ميكروسكوپي | ۲۵ | |
| ٣ـ۵ـ بررسي مقاومت آنتي بيوتيكي باكتريUPEC | ۲۶ | |
| ٣ـ۶ـ بررسي تشكيل بيوفيلم UPEC با روش ميكروتيتر پليت | ۲۶ | |
| ٣ـ٧ـ بررسي هيدروفوبيسيتي UPEC با بهره گرفتن از هيدروكربن اكتان | ۲۶ | |
| ٣ـ٨ـ استخراج DNA با بهره گرفتن از كيت استخراج DNA شركت سينا ژن | ۲۸ | |
| ٣ـ٩ـ تعيين كيفيت DNA با بهره گرفتن از الكتروفورز بر روي ژل آگاروز | ۲۸ | |
| ٣ـ١٠ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR) | ۲۹ | |
| ٣_١١_ الكتروفورز ژل آگارز | ۳۱ | |
| فصل چهارم: نتايج | ||
| ۴ـ١ـ آزمايشات تشخيصي براي تعيين اشريشيا كلي يوروپاتوژن (UPEC) | ۳۳ | |
| ۴ـ٢ـ فراواني باكتريهاي بيماريزاي جدا شده از ادرار | ۳۴ | |
| ۴ـ٣ـ بررسي مقاومت آنتي بيوتيكي باكتري UPEC | ۳۴ | |
| ۴ـ۴ـ بررسي تشكيل بيوفيلم UPEC با روش ميكروتيتر پليت | ۳۶ | |
| ۴ـ۵ـ بررسي هيدروفوبيسيتي UPEC با بهره گرفتن از هيدروكربن اكتان | ۳۸ | |
| ۴ـ۶ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR) | ۴۰ | |
| فصل پنجم: بحث و نتيجه گيري | ||
| ۵ـ١ـ بررسي مقاومت آنتي بيوتيكي باكتري UPEC | ۵۲ | |
| ۵ـ٢ـ بررسي تشكيل بيوفيلم UPEC با روش ميكروتيتر پليت | ۴۴ | |
| ۵ـ٣ـ بررسي هيدروفوبيسيتي UPEC با بهره گرفتن از هيدروكربن اكتان | ۴۵ | |
| ۵ـ۴ـ PCR چند گانه (Multiplex PCR) | ۴۶ | |
| نتيجه گيري | ۴۸ | |
| پيشنهادات | ۴۹ | |
| منابع و مآخذ | ۵۰ | |
| چكيده انگليسي | ۵۷ | |
| فهرست شكل ها | |
| عنوان | صفحه |
| شكل ١_١_ تفاوت Pili و Curli | ۱۱ |
| شكل ١_٢_ كپسول پلي ساكاريدي | ۱۳ |
| شكل١_٣_ مراحل توسعه يافتگي بيوفيلم | ۱۹ |
| شكل۴_١_ كلني ها با جلاي فلزي UPEC | ۳۴ |
| شكل ۴_٢_ باسيل هاي گرم منفي UPEC | ۳۴ |
| شكل ۴_٣_ محيط هاي افتراقي جهت بررسي E.coli جدا شده از ادرار | ۳۴ |
| شكل ۴_۴_ هاله عدم رشد UPEC در حضور آنتي بيوتيك ها | ۳۶ |
| شكل ۴_۵_ تشكيل بيوفيلم UPEC با روش ميكروتيتر پليت با بهره گرفتن از روش اتصال به كريستال ويوله (CV) | ۳۷ |
| شكل ۴_۶_ بررسي هيدروفوبيسيتي(قدرت اتصال) UPEC با بهره گرفتن از هيدروكربن اكتان | ۳۹ |
| شكل ۴_٧_ نتايج الكتروفورز محصولPCR جهت شناساييژن هايpap (328 bp) و sfa (410 bp | ۴۱ |
چكيده
عفونت دستگاه ادراري يكي از شايعترين عفونت هاي بيمارستاني است كه از كلونيزه شدن اشرشيا كلي يوروپاتوژن در اپيتليوم مخاطي ميزبان ناشي مي شود و به بافت ميزبان آسيب مي رساند. ساختارهاي مختلف سطح سلولي در تشكيل بيوفيلم در اشرشياكلي يوروپاتوژن دخيل هستند. از جمله فاكتورهاي سطحي در اتصال باكتري و تشكيل بيوفيلم، پيلي P و S مي باشد. هدف از اين مطالعه تعيين ميزان مقاومت آنتي بيوتيكي ، بررسي تشكيل بيوفيلم اشريشيا كلي يوروپاتوژن، سنجش قدرت اتصالي يا خاصيت هيدروفوبيسيتي آن و بررسي وجود ژن هاي فيمبريه اي pap وsfa و ارتباط آنها در تشكيل بيوفيلم بود.
در اين تحقيق تعداد ۱۰۰ نمونه از كشت باكتري بيماران مشكوك به عفونت دستگاه ادراري (UTI) جمع آوري گرديد. با بهره گرفتن از تست هاي بيوشيميايي متداول E.coli بودن ۷۰ نمونه تاييد گرديد. مقاومت آنتي بيوتيكي باكتري اشريشيا كلي يوروپاتوژن با بهره گرفتن از روش ******by – Bauer مورد بررسي قرار گرفت. تشكيل بيوفيلم اين باكتري با روش ميكروتيترپليت بررسي شد. به منظور بررسي اتصال باكتري و ميزان هيدروفوبيسيتي ، روش هيدروكربن اكتان استفاده شد. پس از استخراج DNA با بهره گرفتن از كيت استخراج، حضور ژن هاي pap و sfa به روش Multiplex PCR مورد بررسي گرفت.
از مجموع ۱۰۰ نمونه مورد بررسي به كمك روش هاي بيوشيميايي متداول ۷۰ نمونه به عنوان اشريشيا كلي يوروپاتوژن شناسايي شدند. نتايج نشان دادن كه اين باكتري با هيدروفوبيسيتي ۲۳% توانايي تشكيل بيوفيلم را دارد. از نظرميزان تشكيل بيوفيلم ۸۶% قدرت بسيار كم، ٨/٢ ٪ قدرت متوسط و ٢/١١٪ داراي قدرت بسيار بالا نشان دادند. همچنين بر اساس نتايج بدست آمده از آزمايش Multiplex PCR بر روي ۱۰ نمونه اي كه بالاترين قدرت تشكيل بيوفيلم را داشتند، ۱۰نمونه (۱۰۰٪) واجد ژن pap، ۷ نمونه (۷۰٪) واجد ژن sfa و ۷ نمونه (۷۰٪) نيز به طور همزمان داراي ژن pap و sfa بودند.
نتايج اين مطالعه نشان داد كه ژن هاي pap و sfa شايعترين ژن هاي كد كننده پيلي در اشريشيا كلي هاي جدا شده از عفونت ادراري هستند كه مي توانند به اتصال اين باكتري به بافت هاي ميزباني و تشكيل بيوفيلم هاي مقاوم به آنتي بيوتيك كمك كنند.
واژه هاي كليدي: عفونتهاي دستگاه ادراري، اشريشيا كلي يوروپاتوژن، تشكيل بيوفيلم، Multiplex PCR
مقدمه:
اشريشيا كلي بيشترين گونه باسيل گرم منفي شايع در فلور مدفوعي است. اين باكتري يك گونه فوق العاده متنوع است كه توانايي كلونيزه شدن و پايداري در نيچ هاي بيشماري در ميزبان هاي حيواني، انساني و محيط را دارد. بعضي از سويه هاي اشرشيا كلي مي توانند از سويه هاي كامنسال خودشان متمايز شوند، بيماريزايي طبيعي بيشتر و توانايي ايجاد بيماريهاي جدي تر در دستگاه گوارش، بافت ها و اندام هاي ديگر ميزبان ايجاد كنند. اين سويه هاي پاتوژن به طور گسترده به عنوان اشرشيا كلي اسهال زا يا اشرشيا كلي پاتوژن خارج روده اي Extra-intestinal Pathogenic E.coli;ExPEC ) ) طبقه بندي مي شوند. از ميان ExPEC ها، سويه هاي اشرشياكلي يوروپاتوژن (Uropathogenic E.coli; UPEC)با بيماريزايي انساني در ارتباط است. سويه هاي UPEC به عنوان فرصت طلب داخل سلولي عمل مي كنند و با توجه به حساسيت و رفتار ميزبان و توسط به كارگيري فاكتورهاي ويرولان مختلف براي كلونيزه شدن در دستگاه ادراري برتري كسب مي كنند. ( Johnson et al. 1998; Johnson. 2002; Marrs et al. 2005)
UPEC در مجاري ادراري مي تواند در مثانه كلونيزه شود و ايجاد التهاب مثانه (Cystitis) كند و همچنين مي تواند از طريق حالب به كليه ها صعود كرده و باعث ايجاد پيلونفريت (Pyelonephritis) شود. مولكول و ساختارهاي مختلف سطح سلولي در تشكيل بيوفيلم در اشرشياكلي يوروپاتوژن دخيل هستند (Marrs et al,2005)
بيوفيلم ها مجموعه اي از سلول هاي ميكروبي هستند كه به طور برگشت ناپذير به سطح وابسته اند و به وسيله شستشو ملايم از بين نمي روند. علاوه بر اين، تمايز سلول هاي غير متصل (Planctonic) به شكل بيوفيلم بالغ، تغييرات فنوتيپي را ايجاد مي كند كه داراي پيامد هاي عمده اي از قبيل افزايش مقاومت به عوامل ضد ميكروبي و ازبين نرفتن توسط دفاع ميزبان است. اين تغييرات فنوتيپي باعث تغيير سلول هاي اشرشيا كلي از حالت غير متصل (Planctonic) به حالت متصل مي شود.(Hanna. 2003)
بيش از ۵۰% همه عفونت هاي باكتريايي گزارش شده شامل تشكيل بيوفيلم اند. رشد بيوفيلم باكتريهاي پاتوژن اغلب منجر به عفونت هايي مي شود كه تحمل به آنتي بيوتيك ها و پاسخ هاي ايمني ميزبان را افزايش مي دهد ( Lane et al.2007).
