| عنوان | صفحه | |
| چكيده | ۱ | |
| مقدمه | ۲ | |
| فصل اول: مروري بر تحقيقات گذشته | ||
| ۱- گياهشناسي سيب زميني | ۴ | |
| ۱-۱) برگ | ۴ | |
| ۱-۲) ساقه | ۴ | |
| ۱-۳) غده | ۵ | |
| ۱-۴) جوانه | ۵ | |
| ۱-۵) ريشه | ۵ | |
| ۱-۶) گل | ۵ | |
| ۲- ارقام سيب زميني | ۵ | |
| ۲-۱) رقم‌هاى خيلى زودرس و زودرس | ۵ | |
| ۲-۲) رقم‌هاى متوسط رس يا ميان‌رس | ۶ | |
| ۲-۳) رقم‌هاى ديررس | ۶ | |
| ۳- تاريخچه | ۷ | |
| ۴- مواد موجود در سيب زميني | ۸ | |
| ۵- مراحل كشت سيب زميني | ۸ | |
| ۵-۱) آماده كردن زمين براي كاشت سيبزميني | ۸ | |
| ۵-۲) آماده‌كردن غده‌ها براى كاشت سيبزميني | ۹ | |
| ۵-۳) كاشتن غده‌ها | ۱۰ | |
| ۵-۴) آبياري سيب زميني | ۱۱ | |
| ۵-۵) كوددهي سيبزميني | ۱۱ | |
| 5 -6) وجين كردن و خاك دادن سيبزميني | ۱۲ | |
| ۵-۷) برداشت | ۱۳ | |
| ۶- مراحل پس از برداشت و فرآوري سيب زميني | ۱۴ | |
| ۷- اهميت اقتصادي سيبزميني | ۱۵ | |
| ۸- ويروسهاي بيماريزاي سيبزميني | ۱۷ | |
| ۹- ويروس ايكس سيبزميني Potato virus X | ۲۰ | |
| ۹-۱) آرايهبندي | ۲۰ | |
| ۹-۲) علائم | ۲۱ | |
| ۹-۳) دامنه ميزباني طبيعي ويروس ايكس سيبزميني | ۲۲ | |
| ۹-۴) گونه هاي ميزباني بكار رفته جهت تشخيص PVX | ۲۳ | |
| ۹-۵) انتقال و انتشار ويروس | ۲۳ | |
| ۹-۶) پراكنش جغرافيايي | ۲۴ | |
| ۹-۷) خصوصيات ژنوم | ۲۴ | |
| ۹-۸) خصوصيات پيكره ويروس | ۲۶ | |
| ۹-۹) تكثير ويروس ايكس سيبزميني در گياه | ۲۷ | |
| ۹-۱۰) تنوع ژنتيكي ويروس ايكس سيبزميني | ۲۸ | |
| ۱۰- روشهاي رديابي ويروس ايكس سيبزميني | ۳۰ | |
| ۱۰-۱) سرولوژي | ۳۰ | |
| ۱۰-۲) بررسيهاي مولكولي واكنش زنجيرهاي پليمراز Polymerase Chain Reaction (PCR) | ۳۲ | |
| ۱۱- مطالعات انجام شده در ايران | ۳۷ | |
| ۱۲- هدف از اين تحقيق | ۴۰ | |
| فصل دوم:مواد و رو شها | ||
| ۱- جمع آوري نمونه از مزارع سيبزميني | ۴۲ | |
| ۲- آزمون الايزا Enzyme-Linked Immunosorbent Assay- ELISA)) | ۴۲ | |
| ۲-۱) تهيه بافرها | ۴۲ | |
| ۲-۱-۱) بافرفسفات پتاسيم(PH, 7.4), (phosphate buffered saline-PBS) | ۴۳ | |
| ۲-۱-۲) بافر پوششي كربنات سديم(PH, 9.6) , (Coating buffer) | ۴۳ | |
| ۲-۱-۳) بافر شستشو (PH,7.4),(Washing buffer) | ۴۳ | |
| ۲-۱-۴) بافر عصاره گيري (PH,7.4),(Extraction buffer) | ۴۳ | |
| ۲-۱-۵) بافر تركيب پادتن-آنزيم (PH,7.4),(Conjugate buffer) | ۴۳ | |
| ۲-۱-۶) بافر زمينه (سوبسترا)(PH, 9.8),(Substrate buffer) | ۴۴ | |
| ۳- بررسيهاي گلخانهاي | ۴۵ | |
| ۴- بررسي انتقال | ۴۶ | |
| ۴-۱) بررسي انتقال با سس | ۴۶ | |
| ۴-۲) انتقال با تماس | ۴۶ | |
| ۵- بررسي خصوصيات مولكولي | ۴۶ | |
| ۵-۱) استخراج آر.ان.اي (RNA Extraction) | ۴۶ | |
| ۵-۲) واكنش زنجيرهاي پليمراز به روش رونوشت برداري برگردان (RT-PCR) | ۴۸ | |
| ۵-۲-۱) مرحله رونوشت برداري برگردان (Reverse transcriptase) | ۴۸ | |
| ۵-۲-۲) مرحله واكنش زنجيره اي پي. سي. آر | ۴۸ | |
| ۵-۳) مشاهده محصول واكنش | ۴۹ | |
| ۵-۴) خالص سازي قطعات تكثير شده | ۴۹ | |
| ۵-۴-۱) جدا كردن قطعه ژل حاوي DNA تكثير شده | ۴۹ | |
| ۵-۴-۲) حل كردن قطعه ژل و آزاد شده قطعه DNA | ۴۹ | |
| ۵-۴-۳)رسوب دادن DNA | ۵۰ | |
| ۵-۴-۴)شستشوي رسوب با بافر شستشو | ۵۰ | |
| ۵-۴-۵) حل شدن DNA در آب | ۵۰ | |
| ۵-۶) آناليز تبارازيي | ۵۱ | |
| ۶- خالص سازي ويروس PVX | ۵۳ | |
| ۷- اسپكتروفتومتري و تعيين غلظت ويروس جدا شده در آموده هاي(پرپارسيون) خالص شده | ۵۵ | |
| فصل سوم:نتيجه گيري | ||
| ۱- بررسي علائم آلودگيهاي موجود روي سيب زميني | ۵۶ | |
| ۱-۱) علائم آلودگي روي سيب زميني | ۵۶ | |
| ۱-۲) نشانه هاي آلودگي روي گوجه فرنگي | ۵۷ | |
| ۲- آزمون بيولوژيكي (واكنش گياهان محك در مقابل عصاره حاوي ويروس ايكس) | ۵۸ | |
| ۲-۱) گل تكمهايي Gomphrena globosa L. | ۵۸ | |
| ۲-۲) داتوره Datura stramonium | ۵۹ | |
| ۲-۳) سلمكChenopodium amaranticolor | ۵۹ |
| ۲-۴) توتون Nicotiana glutinosa L | ۶۰ |
| ۲-۵) توتون Nicotiana tabacum. cv. White Burley | ۶۰ |
| ۲-۶) توتون Nicotiana tabacum. cv. Samsun | ۶۱ |
| ۲-۷) گوجه فرنگي Lycopersicum esculentum Mill | ۶۱ |
| ۲-۸) لوبيا Phaseolus vulgaris L.cv. Bountiful | ۶۱ |
| ۲-۹) باقلا. Vicia faba | ۶۱ |
| ۲-۱۰) ماش. Vicia sativa L. | ۶۲ |
| ۲-۱۱) دامنه ميزباني و علائم | ۶۲ |
| ۳- درجه حرارت غير فعال شدن (TIP) | ۶۳ |
| ۴- آخرين حد رقت (DEP) | ۶۳ |
| ۵- پايداري ويروس در شرايط آزمايشگاه (LIV) | ۶۳ |
| ۶- مطالعه روش هاي انتقال | ۶۳ |
| ۶-۱) انتقال با سس | ۶۳ |
| ۶-۲) انتقال با تماس | ۶۳ |
| ۷- خالص سازي | ۶۳ |
| ۷-۱) روشShepard, 1972 | ۶۳ |
| ۷-۲) روشFribourg,1975 | ۶۴ |
| ۷-۳) روشMoreira, 1980 | ۶۵ |
| ۸- تعيين پراكنش ويروس بر اساس آزمون الايزاELISA | ۶۵ |
| ۹- بررسي خصوصيات مولكولي | ۷۲ |
| ۹-۱) نتايج حاصل از استخراج آر.ان.اي كل گياه (RNA Extraction) | ۷۲ |
| ۹-۲) نتايج واكنش رونوشت برداري برگردان زنجيرهاي پليمراز (RT-PCR) |
۷۳ |
| ۱۰) آناليز تبازايي | ۷۴ |
| فصل چهارم:بحث، نتيجه گيري و پيشنهادات | ۷۶ |
| فهرست منابع فارسي | ۸۴ |
| فهرست منابع انگليسي | ۸۵ |
| چكيده انگليسي | ۹۶ |
| فهرست جداول | ||
| عنوان | صفحه | |
| جدول۱-۱ اسامي ويروس هاي سيب زميني | 18 | |
| جدول ۱-۲ مقايسه بين ELISA, PCR, IC-PCR, RT-PCR-ELISA | ۳۵ | |
| جدول۱-۳ توالي آغازگرهاي استفاده شده براي سنتز cDNA جهت رديابي ويروس ايكس سيبزميني | ۳۷ | |
| جدول۲-۱ منطقه و تعداد نمونه هاي جمع آوري شده از مزارع سيب زميني در همدان | ۴۲ | |
| جدول۲-۲ گياهان ميزباني كه براي مايه زني ويروس ايكس سيب زميني استفاده شد | ۴۵ | |
| جدول۲-۳ آغازگرهاي استفاده شده در آزمون RT-PCR | ۴۹ | |
| جدول۲-۴ ليست توالي‌هاي كامل پروتئين پوششي PVX موجود در بانك ژن كه براي مقايسه با جدايه‌هاي ايراني مورد استفاده قرار گرفته‌اند | ۵۲ | |
| جدول۳-۱درصد نمونه هاي علائم دار جمع آوري شده از مزارع همدان | ۵۷ | |
| جدول۳-۲ علائم ويروس ايكس بروي گياهان محك | ۶۲ | |
| جدول ۳-۳ درصد آلودگي به چهار ويروس PVX، PVY، PVS و PLRV در مناطق بهار، رزن و كبودرآهنگ | ۶۵ | |
| جدول۳-۴ درصد آلودگي همزمان در مزارع استان همدان | ۶۶ | |
| فهرست نمودارها | |
| عنوان | صفحه |
| نمودار۱-۱ توزيع ميزان توليد سيب زميني در استانهاي كشور | ۱۶ |
| نمودار۳-۱(Shepard, 1972) Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation | ۶۴ |
| نمودار۳-۲(Fribourg,1975) Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation | ۶۴ |
| نمودار۳-۳ Ultraviolet- absorption spectra PVX preparation(Moreira,1980) | ۶۵ |
| نمودار۳-۴ نمودار ۳-۴درصد آلودگي در مزارع سيب زميني منطقه بهار | ۶۸ |
| نمودار۳-۵ درصد آلودگي در مزارع سيب زميني در منطقه رزن | ۶۹ |
| نمودار۳-۶ درصد آلودگي مزارع سيب زميني در منطقه كبودر آهنگ | ۷۱ |
| نمودار۳-۷ درصد آلودگي ويروس هاي سيب زميني در مزارع سيب زميني استان همدان | ۷۲ |
| فهرست اشكال | |
| عنوان | صفحه |
| شكل۱-۱ ويروس PVX همراه با ويروس TMV حالت هم افزايي داشته و علائم شديد Double streak را ايجاد مي كند | ۲۱ |
| شكل۱-۲ گياه سيب زميني آلوده به ويرو س ايكس سيب زميني با علائم موزاييك | ۲۲ |
| شكل۱-۳ مدل حركت Potexivirus | ۲۶ |
| شكل۱-۴ مقايسه حساسيت روش هاي RT-PCR(A) و DAS-ELISA (B) براي رديابي ويروس ايكس سيب زميني | ۳۴ |
| شكل ۳-۱ علائم موزائيك و نكروز در بوته سيب زميني آلوده به دو ويروس ايكس و واي سيب زميني | ۵۷ |
| شكل ۳-۲ نمونه گوجه فرنگي مشكوك به علائم ويروسي | ۵۸ |
| شكل۳-۳ لكه هاي نكروز، ۱۵ روز پس از مايه زني عصاره حاويPVX روي گل تكمه ايي | ۵۸ |
| شكل۳-۴ لكه هاي سبز روشن پس از ۱۰ روز مايه زني عصاره حاويPVX روي داتوره | ۵۹ |
| شكل۳-۵ ظهور لكه هاي سبزرد( كلروتيك) (سمت راست) و سپس سيستميك در گياه سلمك (سمت چپ) | ۵۹ |
| شكل۳-۶ لكههاي سبزرد (كلروتيك) و موزاييك روي برگ N.glutinosa L مايه زني شده توسط عصاره حاويPVX | ۶۰ |
| شكل۳-۷علائم پيسك (ماتل)و رگبرگ روشني روي Nicotiana tabacum. cv.White Burley مايه زني شده توسط جدايه PVX | ۶۰ |
| شكل۳-۸ علائم لكه هاي كلروز و نكروز سيستميك در گياه گوجه فرنگي ۱۲ روز بعد از مايه زني توسط PVX | ۶۱ |
| شكل۳-۹ علائم زردي و موزائيك روي برگهاي ماش مايه زني شده توسط عصاره حاويPVX | ۶۲ |
| شكل۳-۱۰ عكس از باند حاصل شده ازRNA استخراج شده بروش Tri-Reagent | ۷۳ |
| شكل ۳-۱۱ الكتروفورز محصولات PCR مربوط به تكثير پروتئين پوششي با بهره گرفتن از آغازگرهاي اختصاصي، در ژل آگاروز يك درصد | ۷۴ |
| شكل ۳-۱۲ درخت تبارزايي جدايه‌هاي ايراني PVX با ساير جدايه‌ها كه با روش NJ و ۱۰۰ مرتبه bootstrap بدست آمده است. | ۷۵ |
چكيده:
ويروس ايكس سيبزميني (Potato virus X- PVX) گونه شاخص جنس Potexvirus از خانواده Alfaflexiviridae ميباشد. طي سال هاي ۱۳۸۹ و ۱۳۹۰، از مناطق كشت اصلي سيب زميني در استان همدان بازديد و نمونه برداري انجام گرفت. مجموعاً ۴۵۶ نمونه برگي (تعداد ۱۳۲ و ۳۲۴ نمونه بترتيب علائمدار و تصادفي) از ۹ مزرعه واقع در مناطق بهار، كبودرآهنگ و رزن جمع آوري گرديد. نتايج آزمون الايزا با بهره گرفتن از آنتي بادي اختصاصي (بيوربا-سويس) نشان دهنده آلودگي ۴۲ نمونه با ويروس ايكس سيب زميني بود. بر اساس آزمون الايزا ميزان وقوع آلودگي به اين ويروس به ترتيب كاهش در مناطق بهار، رزن و كبودرآهنگ تعيين گرديد. براي تاييد نتايج حاصل از آزمون سرولوژيكي از روش هاي بيولوژيكي و مولكولي استفاده شد. مطالعه دامنه ميزباني جدايه هاي ايراني ويروس ايكس سيب زميني با بهره گرفتن از گياهان محك مختلف، تفاوتي نشان داد. همچنين در اين تحقيق ناحيه ژن پروتئين پوششي ويروس بطول حدود ۷۵۰ جفت باز با بهره گرفتن از آغازگر هاي اختصاصي تكثير گرديد. آناليز تبارزايي با بهره گرفتن از توالي كامل پروتئين پوششي دو جدايه ويروس شامل Iran H1 و Iran H2 با توالي‌هاي مربوط به جدايه هاي خارجي PVX موجود در بانك ژن نشان داد كه جدايه هاي ايراني در گروه اروپا-آسيا (Eurasia) قرار مي گيرند. در درخت تبارزايي جدايه هاي تعيين توالي شده در اين بررسي با جدايه ويروس ايكس جدا شده از نخود (Pisum sativum) در يك شاخه مستقل و نزديك بهم قرار گرفتند. طول كامل توالي پروتئين پوششي ۷۱۴ نوكلئوتيد بود كه پروتئيني با ۲۳۷ اسيدآمينه توليد مي نمايد. اين نتايج با نتايج بدست آمده در مورد ساير جدايه هاي اين ويروس از مناطق ديگر دنيا مطابقت دارد. هر چند كه جدايه هاي ايراني مورد مطالعه در گروه اروپا-آسيا قرار مي گيرند ولي هنوز مشخص نيست كه آنها جدايه هاي غالب اين ويروس در ايران باشند. براي اين منظور لازم است تا جدايه هاي بيشتري از اين ويروس از مناطق خاورميانه و ساير كشورها تعيين توالي شوند. هر چند بر اساس مطالعات ما اين اولين گزارش از آناليز تبارزايي اين ويروس جدا شده از سيب زميني از ايران
